A sejtimmunitás válasza az influenza elleni védőoltásra rheumatoid arthritisben szenvedő betegeknél

Hatvan RA-s beteg és 30 egészséges, idős, egyező kontrollcsoport vesz részt a vizsgálatban.

A beleegyező nyilatkozat aláírása után minden alany beoltásra kerül a WHO által jövő ősszel javasolt, inaktivált osztott virion vakcinával.

A betegeket a 0. héten és 6 héttel később értékelik. A klinikai értékelés a Disease Activity Score 28-on (DAS 28) alapul, amely magában foglalja a duzzadt és érzékeny ízületek számát, az orvos vizuális átfogó értékelését, valamint az ESR és a CRP vérét, amelyet az oltás napján és 6 héttel később kell gyűjteni.

Perifériás vér mononukleáris sejtek előkészítése Vérmintákat vesznek a vakcinázás előtt és 4 héttel azt követően. A perifériás vér mononukleáris sejtjeit (PBMC) heparinizált vér Lymphoprep gradiens (Nycomed, Oslo, Norvégia) centrifugálásával izoláljuk. A sejteket kétszer mossuk RPMI szövettenyésztő tápközegben (RPMI1640-Hepes with Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, USA), és 2 106/ml koncentrációra szuszpendáljuk RPMI 1640-ben, amelyet 10% hővel inaktivált borjúmagzati szérummal (FBS) egészítünk ki. ) (GIBCO BRL, NY, USA).

ELISPOT vizsgálat A 96 lyukú PVDF (polivinilidén-difluorid, Millipore Corp., MA, USA) lemezeket 70%-os EtOH-val előnedvesítjük, majd mérőhelyenként 100 l anti-humán IFN-monoklonális antitesttel (mAb) 1-D1K vonjuk be, 15 g/ml-re hígítva steril szűrt foszfáttal pufferelt sóoldatban (PBS). A lemezeket egy éjszakán át 4 °C-on tartjuk. Összesen 100 000 PBMC plusz 5 l/lyuk (1 g/ml) peptidet adunk minden egyes üreghez két párhuzamosban minden körülmények között, és 24 órán át 37 °C-on, 5% CO2-ban inkubáljuk. Inkubálás után a lemezeket PBS-sel mostuk, majd 100 l biotinilezett mAb-t (7-B6-1-biotin, Mabtech AB), szűrt PBS-sel 0,5% FBS-sel 1 g/ml koncentrációra hígítottunk minden egyes lyukba. A lemezeket 2 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk, PBS-sel mossuk, majd 100 l/lyuk sztreptavidin-alkáli foszfatázzal (Mabtech AB) 1-1000-re hígítva 0,5% FBS-t tartalmazó PBS-sel 1 órán át inkubáljuk szobahőmérsékleten. Mosás után a sejteket 100 l/lyuk kolorimetriás szubsztrát (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) hozzáadásával fejlesztik, majd ELISPOT olvasóban megszámlálják. Minden foltot egyetlen IFN-t szekretáló T-sejtfolt-formáló sejt (SFC) termelt. Minden tesztet két párhuzamosban végeztünk, és az átlagértékeket kiszámítottuk. A válasz akkor tekinthető pozitívnak, ha a foltok száma a peptiddel stimulált sejteket tartalmazó üregekben a háttér kivonása után (peptidstimuláció nélküli üregek) legalább kétszerese a háttérfoltok számának14 vagy több. mint 20/106 SFC.

Az intracelluláris citokintermelés kimutatása áramlási citometriával Az intracelluláris festési módszert a peptidstimulációval aktivált INF-termelő T-sejtek fenotípusának azonosítására használjuk. A festést a Rauser és munkatársai által leírt protokoll szerint végezzük.15 A PBMC-ket 6 órán át 1 g/ml influenza peptidekkel stimuláltuk. Az inkubáció utolsó 4 órájában Brefeldin A-t (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) adunk hozzá. Pozitív kontrollt kapunk, ha a sejteket 0,5 g/ml PMA-val (Phorbol 12-myrestate 13-acetate) és 1 g/ml Ionomycinnel (mindkettő a Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) stimuláljuk. A sejteket permeabilizáljuk, és fluorokrómmal jelölt anti-CD3, anti-CD4 vagy anti-CD8 és anti-IFN-antitestekkel (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) festjük. A mintákat áramlási citometriával elemezzük FACSCalibur (Becton Dickinson) alkalmazásával. A teszt pozitív határa az IFN-termelő T-sejtek 0,05%-a volt.

A specifikus CD4+ és CD8+ proliferációja A celluláris választ úgy értékeljük, hogy egyidejűleg elemezzük a specifikus T CD4+ és CD8+ limfociták proliferációját a vakcinában jelenlévő három vírustörzs antigénjeivel, és ugyanazon sejtek aktiváló Th1 citokinek termelésével.

Röviden, az influenza-specifikus T-sejtek proliferációjának és citokintermelésének egyidejű elemzéséhez a perifériás vér mononukleáris sejtjeit T0-ban és T1-ben minden donortól nyerjük, fluoreszcens nukleáris festékkel karboxifluoreszcein-szukcinimidil-észterrel (CFSE; Molecular Probes) festjük, és két példányban tenyésztjük. a vizsgálatban használt influenzavírus-vakcinában vagy a kontrollpeptidben található vírustörzsekből származó HA-peptidek jelenléte 72 órán keresztül. Az inkubálás végén a tenyészeteket brefeldinnel leállítjuk, a sejteket újraszuszpendáljuk, fluorokrómmal konjugált anti-CD8 és anti-interferon-γ (IFN-γ) monoklonális antitestekkel (Becton&Dickinson) festjük, és hatszínű áramlási citométerrel analizáljuk. (FACSanto-Becton&Dickinson) és FACS DIVA szoftver. Mint minden sejtosztódásnál a nukleáris fluoreszcencia felére csökken, a proliferáló sejtek a citogram bal negyedébe esnek, minél több osztódás, annál kisebb a fluoreszcencia. Az IFN-y termelő sejtek a citogramok felső negyedébe esnek. Azok a sejtek, amelyek specifikus influenza peptid vagy kontroll peptid stimuláció hatására szaporodnak és aktívan termelnek IFN-γ-t (Th1 citokin), a citogram bal felső negyedébe esnek. Meghatároztuk gyakoriságukat (proliferáló és IFN-y-termelő sejtek/összes T-CD4+ vagy CD8+ limfociták).

Hemagglutinációs gátlási teszt A vakcina immunogenitását hemagglutinációs gátlási (HI) teszttel vizsgáltuk.

Az influenzavírusnak két fontos felszíni glikoproteinje van: a hemagglutinin (HA) és a neuraminidáz (NA). Az influenzavírusok antigén osztályozása és altípusa ezen a két glikoproteinen alapul. A HA kulcsszerepet játszik a vírussejtekbe való bejutásban, mivel a sejtfelszíni receptorokhoz kötődik, amelyek bizonyos fajok vörösvérsejtjein is megtalálhatók. A vörösvértestekhez való kötődés hemagglutinációt eredményez, amely agglutinált vörösvértestek szőnyegeként figyelhető meg egy cső vagy mikrotitráló lyuk alján. A HI-tesztben a vírusos hemagglutininek elleni antitest blokkolja a vírus kötődését a vérsejtekhez, így gátolja a hemagglutinációs reakciót.

Az immunizálás előtti és utáni HI-antitesteket az izraeli Egészségügyi Minisztérium Központi Virológiai Laboratóriumában tesztelték a HI-teszttel a WHO szabványos eljárása 16 szerint. A szérumokat elválasztottuk, kódjelzéssel elláttuk, és a tesztelésig -20 °C-on tároltuk. A szérumokat receptorromboló enzim kolera szűrletével kezelték a nem specifikus inhibitorok eltávolítása érdekében, és pulyka vörösvértestekkel, hogy eltávolítsák a nem specifikus agglutinineket. A kezelt szérumokat HI teszttel teszteltük a vakcinában található három antigén ellen: A/California (CAL), B/Shangai (SHAN) és A/New Caledonia (NC). Mindegyik antigén munkahígítása (tesztdózisa) négy hemagglutinin egységet tartalmazott 25 µl antigénben. A tesztdózisokat foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS) hígítottuk, és hozzáadtuk az antiszérum sorozathígításához. A hemagglutinin gátlási titert a szérum azon legmagasabb hígításaként határoztuk meg, amely teljes mértékben gátolja a vörösvértestek hemagglutinációját.

A gátlást nem mutató antiszérum titerét <10-nek vettük fel. A humorális választ úgy határozták meg, mint a titer négyszeres vagy nagyobb emelkedése, vagy a HI-antitestek nem protektív alapszintjének <1/40-ről 1/40-re való emelkedése négy héttel az oltás után 17,18. Az antitestek geometriai átlagtitereit kiszámítottuk, hogy értékeljük az egész csoport immunitását.

A vizsgálat elsődleges végpontja: a gamma-interferont termelő sejtek aránya rheumatoid arthritisben szenvedő betegekben és kontrollokban Másodlagos végpont: a vakcina biztonságossága