Réponse immunitaire cellulaire à la vaccination contre la grippe chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde

Soixante patients atteints de PR et 30 témoins appariés en bonne santé et âgés participeront à l'étude.

Après signature du consentement éclairé, tous les sujets seront vaccinés avec le vaccin à virion fragmenté inactivé qui sera recommandé par l'OMS à l'automne prochain.

Les patients seront évalués à 0 et 6 semaines plus tard. L'évaluation clinique sera basée sur le score d'activité de la maladie 28 (DAS 28) qui comprend le nombre d'articulations enflées et douloureuses, l'évaluation visuelle globale du médecin, l'ESR et le CRP Le sang doit être prélevé le jour de la vaccination et 6 semaines plus tard.

Préparation des cellules mononucléaires du sang périphérique Des échantillons de sang seront obtenus avant et 4 semaines après la vaccination. Les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) seront isolées par centrifugation de sang héparinisé sur un gradient Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norvège). Les cellules seront lavées deux fois dans du milieu de culture tissulaire RPMI (RPMI1640-Hepes with Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, USA) et remises en suspension à une concentration de 2 106/ml dans du RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum bovin fœtal inactivé à la chaleur (FBS ) (GIBCO BRL, NY, États-Unis).

Dosage ELISPOT Les plaques 96 puits en PVDF (difluorure de polyvinylidène, Millipore Corp., MA, USA) seront préhumidifiées avec EtOH à 70 %, puis recouvertes de 100 l/puits d'anticorps monoclonal anti-IFN humain (mAb) 1-D1K , dilué à 15 g/ml dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) filtrée stérile. Les plaques seront conservées une nuit à 4°C. Un total de 100 000 PBMC plus 5 l/puits (1 g/ml) de peptides seront ajoutés à chaque puits en double pour chaque condition et incubés pendant 24 h à 37 °C dans 5 % de CO2. Après incubation, les plaques seront lavées avec du PBS puis 100 l de mAb biotinylé (7-B6-1-biotine, Mabtech AB), dilué dans du PBS filtré avec 0,5% de FBS à la concentration de 1 g/ml ont été ajoutés dans chaque puits. Les plaques seront incubées 2 h à température ambiante, lavées avec du PBS puis incubées avec 100 l/puits de streptavidine-phosphatase alcaline (Mabtech AB) diluées au 1-1000 dans du PBS avec 0,5 % de FBS pendant 1 h à température ambiante. Après lavage, les cellules seront développées en ajoutant 100 l/puits de substrat colorimétrique (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) puis comptées dans un lecteur ELISPOT. Chaque tache a été produite par une seule cellule formant des taches de lymphocytes T sécrétant de l'IFN (SFC). Tous les tests ont été effectués en double et les valeurs moyennes ont été calculées. Une réponse sera considérée comme positive lorsque le nombre de spots dans les puits avec des cellules stimulées par les peptides, après soustraction du bruit de fond (puits sans stimulation peptidique), sera au moins deux fois supérieur au nombre de spots de fond14 et plus supérieur à 20/106 SFC.

Détection de la production intracellulaire de cytokines par cytométrie en flux La méthode de coloration intracellulaire sera utilisée pour identifier le phénotype des cellules T productrices d'INF activées par stimulation peptidique. La coloration sera réalisée selon le protocole décrit par Rauser et al.15 Les PBMC ont été stimulées pendant 6 h avec 1 g/ml de peptides grippaux. La brefeldine A (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) sera ajoutée pendant les 4 dernières heures de l'incubation. Un contrôle positif sera obtenu en stimulant les cellules avec 0,5 g/ml de PMA (Phorbol 12-myrestate 13-acetate) et 1 g/ml d'ionomycine (tous deux de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Les cellules seront perméabilisées et colorées avec des anticorps anti-CD3, anti-CD4 ou anti-CD8 et anti-IFN marqués au fluorochrome (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Les échantillons seront analysés par cytométrie en flux à l'aide de FACSCalibur (Becton Dickinson). La limite positive pour ce test était de 0,05 % de lymphocytes T producteurs d'IFN.

Prolifération de CD4+ et CD8+ spécifiques La réponse cellulaire sera évaluée en analysant simultanément la prolifération de lymphocytes T CD4+ et CD8+ spécifiques lors de la stimulation avec des antigènes des trois souches virales présentes dans le vaccin et de la production de cytokines Th1 d'activation par les mêmes cellules.

En bref, pour analyser simultanément la prolifération et la production de cytokines par les cellules T spécifiques de la grippe, des cellules mononucléaires du sang périphérique seront obtenues à T0 et T1 de chaque donneur, colorées avec le colorant nucléaire fluorescent carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE ; Molecular Probes) et cultivées en double dans la présence de peptides de HA de chacune des souches virales contenues dans le vaccin contre le virus grippal utilisé dans l'étude ou le peptide témoin pendant 72 h. A la fin de l'incubation, les cultures seront arrêtées avec de la Brefeldine, les cellules remises en suspension, colorées avec des anticorps monoclonaux anti-CD8 et anti-interféron-γ (IFN-γ) conjugués au fluorochrome (Becton&Dickinson) et analysées au moyen d'un cytomètre en flux à six couleurs. (FACSCanto-Becton&Dickinson) et le logiciel FACS DIVA. Comme à chaque division cellulaire, la fluorescence nucléaire est réduite de moitié, les cellules proliférantes tombent dans les quadrants gauches du cytogramme, plus il y a de divisions, moins il y a de fluorescence. Les cellules productrices d'IFN-γ se situent dans les quadrants supérieurs des cytogrammes. Les cellules qui, lors de la stimulation d'un peptide spécifique de la grippe ou d'un peptide de contrôle, prolifèrent et produisent activement de l'IFN-γ (cytokine Th1) se situent dans le quadrant supérieur gauche du cytogramme. Ils ont été mesurés en fréquence (cellules proliférantes et productrices d'IFN-γ/lymphocytes T CD4+ ou CD8+ totaux).

Test d'inhibition de l'hémagglutination L'immunogénicité du vaccin a été testée par le test d'inhibition de l'hémagglutination (IH).

Le virus de la grippe possède deux importantes glycoprotéines de surface : l'hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA). La classification antigénique et le sous-typage des virus de la grippe sont basés sur ces deux glycoprotéines. HA joue un rôle clé dans l'entrée des cellules virales en se liant aux récepteurs de surface cellulaire, qui se trouvent également sur les globules rouges de certaines espèces. La liaison aux globules rouges entraîne une hémagglutination, qui peut être observée sous la forme d'un tapis de globules rouges agglutinés au fond d'un tube ou d'un puits de microtitration. Dans le test IH, les anticorps dirigés contre les hémagglutinines virales empêchent le virus de se lier aux cellules sanguines et inhibent ainsi la réaction d'hémagglutination.

Les anticorps anti-HI pré- et post-vaccination ont été testés au Laboratoire central de virologie du ministère israélien de la Santé à l'aide du test HI selon une procédure standard de l'OMS 16. Les sérums ont été séparés, étiquetés avec un code et conservés à -20°C jusqu'à ce qu'ils soient testés. Les sérums ont été traités avec du filtrat de choléra détruisant les récepteurs pour éliminer les inhibiteurs non spécifiques, et avec des globules rouges de dinde pour éliminer les agglutinines non spécifiques. Les sérums traités ont été testés par test HI contre les trois antigènes inclus dans le vaccin : A/California (CAL), B/Shangai (SHAN) et A/New Caledonia (NC). La dilution de travail (dose test) de chaque antigène contenait quatre unités d'hémagglutinine dans 25 µl d'antigène. Les doses d'essai ont été diluées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et ajoutées à une série de dilutions d'antisérum. Le titre d'inhibition de l'hémagglutinine a été déterminé comme la dilution la plus élevée de sérum qui inhibe complètement l'hémagglutination des globules rouges.

Le titre d'un antisérum ne montrant aucune inhibition a été enregistré comme <10. La réponse humorale a été définie comme une multiplication par quatre ou plus du titre, ou une augmentation à partir d'un niveau de base non protecteur de <1/40 à 1/40 des anticorps IH quatre semaines après la vaccination 17,18. Les titres moyens géométriques d'anticorps ont été calculés pour évaluer l'immunité de l'ensemble du groupe.

Critère principal de l'étude : la proportion de cellules productrices d'interféron gamma chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et les témoins Critère secondaire : la sécurité du vaccin