류마티스관절염 환자의 인플루엔자 예방접종에 대한 세포면역반응

60명의 RA 환자와 30명의 건강하고 나이가 많은 대조 대조군이 연구에 참여할 것입니다.

정보에 입각한 동의서에 서명한 후, 모든 피험자는 내년 가을 WHO에서 권장하는 비활성화 분할 비리온 백신을 접종받게 됩니다.

환자는 0주 및 6주 후에 평가될 것입니다. 임상 평가는 종창 및 압통 관절의 수를 포함하는 DAS 28(Disease Activity Score 28), 의사의 시각적 종합 평가, 예방접종 당일 및 6주 후에 수집된 ESR 및 CRP 혈액을 기반으로 합니다.

말초 혈액 단핵 세포의 준비 백신 접종 전과 4주 후에 혈액 샘플을 채취합니다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 Lymphoprep 구배(Nycomed, Oslo, Norway)에서 헤파린화된 혈액의 원심분리에 의해 분리될 것입니다. 세포를 조직 배양 배지 RPMI(Glutamax-I를 함유한 RPMI1640-Hepes, GIBCO BRL, NY, USA)에서 2회 세척하고 10% 열 불활성화 태아 소 혈청(FBS ) (GIBCO BRL, 뉴욕, 미국).

ELISPOT 분석 96-웰 PVDF(polyvinylidene difluoride, Millipore Corp., MA, USA) 플레이트는 70% EtOH로 미리 적신 다음 100㎕/웰의 항-인간 IFN-단클론 항체(mAb) 1-D1K로 코팅됩니다. 멸균 여과된 인산염 완충 식염수(PBS)에 15g/ml로 희석. 플레이트는 4°C에서 밤새 보관됩니다. 총 100,000개의 PBMC + 5μl/웰(1g/ml) 펩티드를 각 웰에 각 조건에 대해 이중으로 첨가하고 24시간 동안 37°C, 5% CO2에서 인큐베이션합니다. 인큐베이션 후에 플레이트를 PBS로 세척한 다음 0.5% FBS를 포함하는 여과된 PBS에서 농도 1㎍/ml로 희석한 100㎕의 비오티닐화된 mAb(7-B6-1-비오틴, Mabtech AB)를 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 세척한 다음, 실온에서 1시간 동안 0.5% FBS를 포함하는 PBS에서 1-1000 희석된 스트렙타비딘-알칼리 포스파타제(Mabtech AB) 100㎕/웰과 함께 인큐베이션할 것이다. 세척 후, 비색 기질(BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) 100 ㎕/웰을 첨가하여 세포를 발색시킨 후 ELISPOT 판독기에서 계수하였다. 각각의 스폿은 단일 IFN-분비 T 세포 스폿 형성 세포(SFC)에 의해 생성되었습니다. 모든 테스트는 이중으로 수행되었으며 평균값이 계산되었습니다. 반응은 배경(펩티드 자극이 없는 웰)을 뺀 후 펩타이드로 자극된 세포가 있는 웰의 반점 수가 배경 반점의 수보다 2배 이상 많을 때 양성으로 간주됩니다14 이상 20/106 SFC보다.

유동 세포측정법에 의한 세포내 사이토카인 생산의 검출 펩티드 자극에 의해 활성화된 INF-생산 T 세포의 표현형을 확인하기 위해 세포내 염색 방법을 사용할 것이다. 염색은 Rauser 등에 의해 기술된 프로토콜을 사용하여 수행될 것이다.15 PBMC는 1g/ml 인플루엔자 펩티드로 6시간 동안 자극되었다. Brefeldin A(10g/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO)는 배양의 마지막 4시간 동안 추가됩니다. 0.5g/ml PMA(Phorbol 12-myrestate 13-acetate) 및 1g/ml Ionomycin(둘 다 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)으로 세포를 자극하여 양성 대조군을 얻을 것입니다. 세포는 형광색소 표지된 항-CD3, 항-CD4 또는 항-CD8 및 항-IFN-항체(Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로 투과되고 염색될 것입니다. 샘플은 FACSCalibur(Becton Dickinson)를 사용하여 유동 세포 계측법으로 분석됩니다. 이 테스트의 양성 한계는 IFN 생성 T 세포의 0.05%였습니다.

특정 CD4+ 및 CD8+ 세포 반응의 증식은 백신에 존재하는 세 가지 바이러스 변종의 항원으로 자극 시 특정 T CD4+ 및 CD8+ 림프구의 증식과 동일한 세포에 의한 활성화 Th1 사이토카인의 생성을 동시에 분석하여 평가할 것입니다.

간략하게, 인플루엔자 특이적 T 세포에 의한 증식 및 사이토카인 생성을 동시에 분석하기 위해, 말초 혈액 단핵 세포를 각 기증자로부터 T0 및 T1에서 얻고 형광 핵 염료 카르복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE; Molecular Probes)로 염색하고 72시간 동안 연구 또는 대조군 펩티드에 사용된 인플루엔자 바이러스 백신에 함유된 각 바이러스 균주로부터의 HA 펩티드의 존재. 인큐베이션 종료 시 배양은 브레펠딘으로 중단되고, 세포는 재현탁되며, 형광색소 접합 항-CD8 및 항-인터페론-γ(IFN-γ) 단클론 항체(Becton&Dickinson)로 염색되고 6색 유세포 분석기로 분석됩니다. (FACSCanto-Becton&Dickinson) 및 FACS DIVA 소프트웨어 . 모든 세포 분열에서 핵 형광이 절반으로 줄어들고 증식하는 세포는 사이토그램의 왼쪽 사분면에 속하며 분열이 많을수록 형광이 적습니다. IFN-γ 생성 세포는 사이토그램의 상위 사분면에 속합니다. 특정 인플루엔자 펩타이드 또는 제어 펩타이드 자극 시 증식하고 IFN-γ(Th1 사이토카인)를 능동적으로 생성하는 세포는 사이토그램의 왼쪽 상단 사분면에 속합니다. 그들은 빈도(증식 및 IFN-γ 생성 세포/총 T CD4+ 또는 CD8+ 림프구)로 측정되었습니다.

혈구응집 억제 시험 백신의 면역원성은 혈구응집 억제(HI) 시험으로 시험하였다.

인플루엔자 바이러스에는 두 가지 중요한 표면 당단백질인 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다아제(NA)가 있습니다. 인플루엔자 바이러스의 항원 분류 및 아형 분류는 이 두 가지 당단백질을 기반으로 합니다. HA는 특정 종의 적혈구에서도 발견되는 세포 표면 수용체에 결합하여 바이러스 세포 진입에 중요한 역할을 합니다. 적혈구에 결합하면 혈구응집이 일어나며, 이는 튜브 또는 마이크로타이터 웰의 바닥에서 응집된 적혈구의 융단으로 관찰될 수 있습니다. HI 테스트에서 바이러스 혈구응집소에 대한 항체는 바이러스가 혈액 세포에 결합하는 것을 차단하여 혈구응집 반응을 억제합니다.

예방접종 전후 HI 항체는 표준 WHO 절차 16에 따라 HI 테스트를 사용하여 이스라엘 보건부의 중앙 바이러스 연구소에서 테스트되었습니다. 혈청을 분리하고, 코드 라벨을 붙이고, 테스트할 때까지 -20°C에서 보관했습니다. 혈청을 수용체 파괴 효소 콜레라 여액으로 처리하여 비특이적 억제제를 제거하고 칠면조 적혈구로 처리하여 비특이적 응집소를 제거했습니다. 처리된 혈청은 백신에 포함된 3개의 항원: A/California(CAL), B/Shangai(SHAN) 및 A/New Caledonia(NC)에 대해 HI 테스트로 테스트되었습니다. 각 항원의 작업 희석액(시험 용량)에는 항원 25µl에 4개의 헤마글루티닌 단위가 포함되어 있습니다. 시험 용량을 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석하고 항혈청의 연속 희석액에 첨가했습니다. 적혈구응집소 억제 역가는 적혈구의 적혈구응집을 완전히 억제하는 혈청의 최고 희석도로 결정하였다.

어떠한 억제도 나타내지 않는 항혈청의 역가는 <10으로 기록되었다. 체액 반응은 백신 접종 4주 후 HI 항체에서 역가가 4배 이상 상승하거나 비보호 기준선 수준에서 <1/40에서 1/40으로 상승하는 것으로 정의되었습니다17,18. 항체의 기하 평균 역가를 계산하여 전체 그룹의 면역성을 평가했습니다.

연구의 1차 종점: 류마티스 관절염 환자 및 대조군에서 인터페론 감마를 생성하는 세포의 비율 2차 종점: 백신의 안전성