类风湿性关节炎患者接种流感疫苗后的细胞免疫反应

60 名 RA 患者和 30 名年龄匹配的健康对照者将参加该研究。

签署知情同意书后，所有受试者将接种世界卫生组织明年秋季推荐的灭活裂解病毒疫苗。

将在第 0 周和第 6 周后对患者进行评估。 临

外周血单核细胞的制备 将在接种疫苗之前和接种疫苗后 4 周获取血样。 外周血单核细胞 (PBMC) 将通过在 Lymphoprep 梯度（Nycomed，奥斯陆，挪威）上离心肝素化血液来分离。 细胞将在组织培养基 RPMI（RPMI1640-Hepes with Glutamax-I，GIBCO BRL，NY，USA）中洗涤两次，并在补充有 10% 热灭活胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 中重悬至浓度为 2106/ml ) (GIBCO BRL, NY, USA)。

ELISPOT 测定 96 孔 PVDF（聚偏二氟乙烯，Millipore Corp., MA, USA）板将用 70% EtOH 预润湿，然后用 100 μl/孔的抗人 IFN-单克隆抗体 (mAb) 1-D1K 包被，在无菌过滤的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中稀释至 15 g/ml。 将板在 4°C 下保存过夜。 将总共​​ 100 000 个 PBMC 加 5 微升/孔（1 微克/毫升）肽添加到每个孔中，对于每种条件一式两份，并在 37°C 和 5% CO2 中孵育 24 小时。 孵育后，用 PBS 洗涤板，然后将 100 μl 生物素化 mAb（7-B6-1-生物素，Mabtech AB）在过滤后的 PBS 中用 0.5% FBS 稀释至 1 μg/ml 的浓度添加到每个孔中。 将板在室温下孵育 2 小时，用 PBS 洗涤，然后用 100 μl/孔的链霉亲和素-碱性磷酸酶 (Mabtech AB) 在含有 0.5% FBS 的 PBS 中稀释 1-1000 并在室温下孵育 1 小时。 洗涤后，通过添加 100 μl/孔的比色底物（BCIP/NBT-plus，Mabtech AB）显色细胞，然后在 ELISPOT 读数器中计数。 每个斑点均由单个分泌 IFN 的 T 细胞斑点形成细胞 (SFC) 产生。 所有测试均一式两份进行，并计算平均值。 当具有肽刺激细胞的孔中的斑点数在减去背景（没有肽刺激的孔）后至少是背景斑点数的两倍14 或更多时，反应将被视为阳性高于 20/106 SFC。

通过流式细胞术检测细胞内细胞因子的产生 细胞内染色方法将用于鉴定由肽刺激激活的产生 INF 的 T 细胞的表型。 染色将使用 Rauser 等人描述的方案进行。15 PBMC 用 1 g/ml 流感肽刺激 6 小时。 在孵育的最后 4 小时添加 Brefeldin A（10 g/ml，Sigma-Aldrich，St Louis，MO）。 通过用 0.5 g/ml PMA（Phorbol 12-myrestate 13-acetate）和 1 g/ml Ionomycin（均来自 Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA）刺激细胞，将获得阳性对照。 细胞将被透化并用荧光染料标记的抗 CD3、抗 CD4 或抗 CD8 和抗 IFN 抗体（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）染色。 将使用 FACSCalibur (Becton Dickinson) 通过流式细胞术分析样品。 该测试的阳性限度为 0.05% 的 IFN 产生 T 细胞。

特定 CD4+ 和 CD8+ 细胞反应的增殖将通过同时分析特定 T CD4+ 和 CD8+ 淋巴细胞在用疫苗中存在的三种病毒株的抗原刺激后的增殖和相同细胞产生活化 Th1 细胞因子来评估。

简而言之，为了同时分析流感特异性 T 细胞的增殖和细胞因子产生，将在 T0 和 T1 从每个供体获得外周血单核细胞，用荧光核染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE；Molecular Probes）染色并一式两份培养研究中使用的流感病毒疫苗中包含的每种病毒株的 HA 肽或对照肽存在 72 小时。 在孵育结束时，将用布雷菲德菌素停止培养，重悬细胞，用荧光染料偶联的抗 CD8 和抗干扰素-γ (IFN-γ) 单克隆抗体 (Becton&Dickinson) 染色，并通过六色流式细胞仪进行分析(FACSCanto-Becton&Dickinson) 和 FACS DIVA 软件。 在每次细胞分裂时，核荧光减半，增殖细胞落在细胞图的左象限，分裂越多，荧光越少。 产生 IFN-γ 的细胞位于细胞图的上象限。 在特定流感肽或对照肽刺激下增殖并积极产生 IFN-γ（Th1 细胞因子）的细胞位于细胞图的左上象限。 它们被测量为频率（增殖和产生 IFN-γ 的细胞/总 T CD4+ 或 CD8+ 淋巴细胞）。

血凝抑制试验通过血凝抑制(HI)试验检测疫苗的免疫原性。

流感病毒有两种重要的表面糖蛋白：血凝素 (HA) 和神经氨酸酶 (NA)。 流感病毒的抗原分类和亚型是基于这两种糖蛋白。 HA 通过与细胞表面受体结合在病毒细胞进入中发挥关键作用，细胞表面受体也存在于某些物种的红细胞上。 与红细胞结合导致血细胞凝集，可以在试管或微量滴定孔底部观察到凝集红细胞地毯。 在 HI 试验中，针对病毒血凝素的抗体会阻止病毒与血细胞结合，从而抑制血凝反应。

根据 WHO 标准程序 16，使用 HI 测试在以色列卫生部中央病毒学实验室对免疫前和免疫后 HI 抗体进行了测试。 分离血清，标记代码，并储存在 -20°C 直至测试。 血清用受体破坏酶霍乱滤液处理以去除非特异性抑制剂，并用火鸡红细胞去除非特异性凝集素。 经处理的血清通过 HI 测试针对疫苗中包含的三种抗原进行测试：A/加利福尼亚 (CAL)、B/上海 (SHAN) 和 A/新喀里多尼亚 (NC)。 每种抗原的工作稀释度（测试剂量）在 25 µl 抗原中含有四个血凝素单位。 测试剂量在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中稀释，并添加到连续稀释的抗血清中。 血凝素抑制效价被确定为完全抑制红细胞血凝的最高血清稀释度。

未显示任何抑制作用的抗血清的滴度记录为<10。 体液反应被定义为在接种疫苗 17,18 后 4 周，HI 抗体的滴度升高四倍或更多，或者 HI 抗体从 <1/40 的非保护性基线水平升高到 1/40。 计算抗体的几何平均滴度以评估整个组的免疫力。

研究的主要终点：类风湿性关节炎患者和对照组中产生干扰素γ的细胞比例次要终点：疫苗的安全性