Cellimmunitetssvar på vaccination mot influensa hos patienter med reumatoid artrit

Sextio patienter med RA och 30 friska, gamla matchade kontroller kommer att delta i studien.

Efter att ha undertecknat informerat samtycke kommer alla försökspersoner att vaccineras med det inaktiverade delade virionvaccinet som kommer att rekommenderas av WHO nästa höst.

Patienterna kommer att utvärderas vid 0 och 6 veckor senare. Klinisk utvärdering kommer att baseras på Disease Activity Score 28 (DAS 28) som inkluderar antal svullna och ömma leder, visuell global utvärdering av läkaren, ESR och CRP Blod som ska samlas in på vaccinationsdagen och 6 veckor senare.

Beredning av mononukleära celler från perifert blod Blodprover kommer att tas före och 4 veckor efter vaccination. Perifera mononukleära blodceller (PBMC) kommer att isoleras genom centrifugering av hepariniserat blod på en Lymphoprep-gradient (Nycomed, Oslo, Norge). Celler kommer att tvättas två gånger i vävnadsodlingsmedium RPMI (RPMI1640-Hepes med Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, USA) och återsuspenderas till en koncentration av 2 106/ml i RPMI 1640 kompletterat med 10 % värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) ) (GIBCO BRL, NY, USA).

ELISPOT-analys 96-brunnars PVDF-plattorna (polyvinylidendifluorid, Millipore Corp., MA, USA) kommer att förvätas med 70 % EtOH och sedan beläggas med 100 l/brunn av anti-human IFN-monoklonal antikropp (mAb) 1-D1K , utspädd till 15 g/ml i sterilfiltrerad fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Plattorna kommer att förvaras över natten vid 4°C. Totalt 100 000 PBMC plus 5 l/brunn (1 g/ml) peptider kommer att läggas till varje brunn i duplikat för varje tillstånd och inkuberas i 24 timmar vid 37°C i 5 % CO2. Efter inkubation kommer plattorna att tvättas med PBS, sedan sattes 100 1 biotinylerad mAb (7-B6-1-biotin, Mabtech AB), utspädd i filtrerad PBS med 0,5 % FBS till koncentrationen 1 g/ml till varje brunn. Plattorna kommer att inkuberas 2 timmar vid rumstemperatur, tvättas med PBS och sedan inkuberas med 100 l/brunn av streptavidin-alkaliskt fosfatas (Mabtech AB) utspätt 1-1000 i PBS med 0,5 % FBS under 1 timme vid rumstemperatur. Efter tvättning kommer cellerna att utvecklas genom att tillsätta 100 l/brunn av kolorimetriskt substrat (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) och sedan räknas i en ELISPOT-läsare. Varje fläck producerades av en enda IFN-utsöndrande T-cell-fläckbildande cell (SFC). Alla tester utfördes i duplikat och medelvärdena beräknades. Ett svar kommer att anses vara positivt när antalet fläckar i brunnarna med peptidstimulerade celler, efter subtraktion av bakgrunden (brunnar utan peptidstimulering), kommer att vara minst två gånger större än antalet bakgrundsfläckar14 och mer än 20/106 SFC.

Detektion av intracellulär cytokinproduktion genom flödescytometri Den intracellulära färgningsmetoden kommer att användas för att identifiera fenotypen av INF-producerande T-celler som aktiveras av peptidstimulering. Färgningen kommer att utföras med användning av det protokoll som beskrivs av Rauser et al.15 PBMC stimulerades under 6 timmar med 1 g/ml influensapeptider. Brefeldin A (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) kommer att tillsättas under de sista 4 timmarna av inkubationen. En positiv kontroll kommer att erhållas genom att stimulera cellerna med 0,5 g/ml PMA (Phorbol 12-myrestat 13-acetat) och 1 g/ml Ionomycin (båda från Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Cellerna kommer att permeabiliseras och färgas med fluorokrommärkta anti-CD3, anti-CD4 eller anti-CD8 och anti-IFN-antikroppar (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Proverna kommer att analyseras med flödescytometri med FACSCalibur (Becton Dickinson). Den positiva gränsen för detta test var 0,05 % av IFN-producerande T-celler.

Proliferation av specifik CD4+ och CD8+ Cellulär respons kommer att utvärderas genom att samtidigt analysera proliferation av specifika T CD4+ och CD8+ lymfocyter efter stimulering med antigener från de tre virusstammarna som finns i vaccinet och produktion av aktiverings Th1 cytokiner av samma celler.

Kortfattat, för att samtidigt analysera proliferation och cytokinproduktion av influensaspecifika T-celler, kommer perifera mononukleära blodceller att erhållas vid T0 och T1 från varje givare, färgade med det fluorescerande kärnfärgämnet karboxifluoresceinsuccinimidylester (CFSE; Molecular Probes) och odlas i duplikat närvaron av peptider av HA från var och en av virusstammarna som ingår i influensavirusvaccinet som används i studien eller kontrollpeptiden under 72 timmar. Vid slutet av inkubationen stoppas kulturerna med brefeldin, cellerna återsuspenderas, färgas med fluorokrom-konjugerade anti-CD8 och anti-interferon-y (IFN-y) monoklonala antikroppar (Becton&Dickinson) och analyseras med hjälp av en sexfärgsflödescytometer (FACSanto-Becton&Dickinson) och FACS DIVA programvara . Som vid varje celldelning halveras kärnfluorescensen, prolifererande celler faller i cytogrammets vänstra kvadranter, ju fler delningar desto mindre fluorescens. IFN-y-producerande celler faller i de övre kvadranter av cytogrammen. Celler som vid specifik influensapeptid eller styr peptidstimulering både prolifererar och producerar aktivt IFN-y (Th1-cytokin) faller i den övre vänstra kvadranten av cytogrammet. De mättes som frekvens (prolifererande och IFN-y-producerande celler/total T CD4+ eller CD8+ lymfocyter).

Hemagglutinationsinhiberingstest Vaccinets immunogenicitet testades med hemagglutinationsinhiberingstest (HI).

Influensavirus har två viktiga ytglykoproteiner: hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA). Antigenklassificering och subtypning av influensavirus baseras på dessa två glykoproteiner. HA spelar en nyckelroll i viruscellernas intrång genom att binda till cellytreceptorer, som även finns på röda blodkroppar av vissa arter. Bindning till röda blodkroppar resulterar i hemagglutination, som kan observeras som en matta av agglutinerade röda blodkroppar i botten av ett rör eller en mikrotiterbrunn. I HI-testet blockerar antikroppar riktade mot de virala hemagglutininerna viruset från att binda till blodkropparna och hämmar därmed hemagglutinationsreaktionen.

HI-antikropparna före och efter immunisering testades vid det israeliska hälsoministeriets centrala virologilaboratorium med hjälp av HI-testet enligt ett standardförfarande för WHO 16. Sera separerades, kodmärktes och lagrades vid -20°C tills de testades. Sera behandlades med receptorförstörande enzymkolerafiltrat för att avlägsna ospecifika inhibitorer och med röda blodkroppar från Turkiet för att avlägsna ospecifika agglutininer. De behandlade serumen testades med HI-test mot de tre antigenerna som ingår i vaccinet: A/California (CAL), B/Shangai (SHAN) och A/New Caledonia (NC). Arbetsutspädningen (testdosen) av varje antigen innehöll fyra hemagglutininenheter i 25 µl antigen. Testdoser späddes i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sattes till serieutspädning av antiserum. Hemagglutinin-inhiberingstitern bestämdes som den högsta utspädningen av serum som fullständigt hämmar hemagglutination av röda blodkroppar.

Titern för ett antiserum som inte visade någon hämning registrerades som <10. Humoral respons definierades som antingen en fyrfaldig eller mer ökning av titern, eller en ökning från en icke-skyddande baslinjenivå på <1/40 till 1/40 i HI-antikroppar fyra veckor efter vaccination 17,18. Geometriska medeltitrar av antikropp beräknades för att bedöma immuniteten för hela gruppen.

Studiens primära slutpunkt: andelen celler som producerar interferon gamma hos patienter med reumatoid artrit och kontroller Sekundär slutpunkt: vaccinets säkerhet