Celimmuniteitsrespons op vaccinatie tegen griep bij patiënten met reumatoïde artritis

Zestig patiënten met RA en 30 gezonde, gematchte leeftijdsgroepen zullen deelnemen aan het onderzoek.

Na ondertekening van de geïnformeerde toestemming zullen alle proefpersonen worden gevaccineerd met het geïnactiveerde gesplitste virionvaccin dat volgend najaar door de WHO zal worden aanbevolen.

Patiënten worden na 0 en 6 weken later geëvalueerd. Klinische evaluatie zal gebaseerd zijn op de Disease Activity Score 28 (DAS 28) die het aantal gezwollen en gevoelige gewrichten omvat, visuele globale evaluatie van de arts, ESR en CRP Bloed wordt afgenomen op de dag van vaccinatie en 6 weken later.

Bereiding van mononucleaire cellen uit perifeer bloed Bloedmonsters zullen worden afgenomen voor en 4 weken na vaccinatie. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) zullen worden geïsoleerd door centrifugatie van gehepariniseerd bloed op een Lymphoprep-gradiënt (Nycomed, Oslo, Noorwegen). Cellen worden tweemaal gewassen in weefselkweekmedium RPMI (RPMI1640-Hepes met Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, VS) en geresuspendeerd tot een concentratie van 2 106/ml in RPMI 1640 aangevuld met 10% door hitte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS ) (GIBCO BRL, NY, VS).

ELISPOT-assay De PVDF-platen met 96 putjes (polyvinylideendifluoride, Millipore Corp., MA, VS) worden voorbevochtigd met 70% EtOH en vervolgens gecoat met 100 l/putje anti-humaan IFN-monoklonaal antilichaam (mAb) 1-D1K, verdund tot 15 g/ml in steriele gefilterde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De platen worden een nacht bewaard bij 4°C. Een totaal van 100.000 PBMC plus 5 l/putje (1 g/ml) peptiden zullen voor elke conditie in tweevoud aan elk putje worden toegevoegd en gedurende 24 uur bij 37°C in 5% CO2 worden geïncubeerd. Na incubatie worden de platen gewassen met PBS en vervolgens wordt 100 1 gebiotinyleerd mAb (7-B6-1-biotine, Mabtech AB), verdund in gefilterd PBS met 0,5% FBS tot een concentratie van 1 g/ml aan elk putje toegevoegd. De platen worden 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd, gewassen met PBS en vervolgens geïncubeerd met 100 l/putje streptavidine-alkalische fosfatase (Mabtech AB) 1-1000 verdund in PBS met 0,5% FBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na het wassen worden de cellen ontwikkeld door toevoeging van 100 l/well colorimetrisch substraat (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) en vervolgens geteld in een ELISPOT-lezer. Elke spot werd geproduceerd door een enkele IFN-uitscheidende T-cel-spotvormende cel (SFC). Alle tests werden in tweevoud uitgevoerd en de gemiddelde waarden werden berekend. Een respons wordt als positief beschouwd wanneer het aantal spots in de wells met peptide-gestimuleerde cellen, na aftrek van de achtergrond (wells zonder peptidestimulatie), ten minste twee keer zo groot zal zijn als het aantal background spots14 en meer dan 20/106 SFC.

Detectie van intracellulaire cytokineproductie door flowcytometrie De intracellulaire kleuringsmethode zal gebruikt worden voor het identificeren van het fenotype van INF-producerende T-cellen geactiveerd door peptidestimulatie. De kleuring zal worden uitgevoerd volgens het protocol beschreven door Rauser et al.15 PBMC werden gedurende 6 uur gestimuleerd met 1 g/ml influenzapeptiden. Brefeldin A (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zal gedurende de laatste 4 uur van de incubatie worden toegevoegd. Een positieve controle wordt verkregen door de cellen te stimuleren met 0,5 g/ml PMA (Phorbol 12-myrestate 13-acetaat) en 1 g/ml Ionomycine (beide van Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS). De cellen zullen worden gepermeabiliseerd en gekleurd met fluorochroom-gelabelde anti-CD3, anti-CD4 of anti-CD8 en anti-IFN-antilichamen (Becton Dickinson, San Jose, CA, VS). Monsters zullen worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie met behulp van FACSCalibur (Becton Dickinson). De positieve limiet voor deze test was 0,05% IFN-producerende T-cellen.

Proliferatie van specifieke CD4+ en CD8+ Cellulaire respons zal geëvalueerd worden door gelijktijdig de proliferatie van specifieke T CD4+ en CD8+ lymfocyten te analyseren na stimulatie met antigenen van de drie virusstammen die in het vaccin aanwezig zijn en productie van activatie Th1 cytokinen door dezelfde cellen.

In het kort, om gelijktijdig de proliferatie en cytokineproductie door influenza-specifieke T-cellen te analyseren, zullen perifere mononucleaire bloedcellen worden verkregen op T0 en T1 van elke donor, gekleurd met de fluorescerende nucleaire kleurstof carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE; Molecular Probes) en in tweevoud gekweekt in de aanwezigheid van HA-peptiden van elk van de virusstammen in het griepvirusvaccin dat in de studie werd gebruikt of het controlepeptide gedurende 72 uur. Aan het einde van de incubatie worden de kweken gestopt met brefeldin, worden de cellen opnieuw gesuspendeerd, gekleurd met fluorochroom-geconjugeerde anti-CD8 en anti-interferon-γ (IFN-γ) monoklonale antilichamen (Becton&Dickinson) en geanalyseerd door middel van een zeskleuren flow-cytometer (FACSCanto-Becton&Dickinson) en FACS DIVA-software . Aangezien bij elke celdeling de kernfluorescentie wordt gehalveerd, vallen prolifererende cellen in de linker kwadranten van het cytogram, hoe meer delingen hoe minder fluorescentie. IFN-γ-producerende cellen vallen in de bovenste kwadranten van de cytogrammen. Cellen die na specifiek influenza-peptide of gecontroleerde peptide-stimulatie zowel prolifereren als actief IFN-γ (Th1-cytokine) produceren, vallen in het kwadrant linksboven van het cytogram. Ze werden gemeten als frequentie (prolifererende en IFN-γ-producerende cellen/totaal T CD4+- of CD8+-lymfocyten).

Hemagglutinatieremmingstest De immunogeniciteit van het vaccin werd getest met de hemagglutinatieremmingstest (HI).

Influenzavirus heeft twee belangrijke oppervlakteglycoproteïnen: het hemagglutinine (HA) en het neuraminidase (NA). Antigene classificatie en subtypering van influenzavirussen is gebaseerd op deze twee glycoproteïnen. HA speelt een sleutelrol bij het binnendringen van virussen door zich te binden aan receptoren op het celoppervlak, die ook worden aangetroffen op rode bloedcellen van bepaalde soorten. Binding aan rode bloedcellen resulteert in hemagglutinatie, die kan worden waargenomen als een tapijt van geagglutineerde rode bloedcellen op de bodem van een buisje of microtiterholte. Bij de HI-test blokkeren antilichamen gericht tegen de virale hemagglutininen de binding van het virus aan de bloedcellen en remmen zo de hemagglutinatiereactie.

De pre- en post-immunisatie HI-antilichamen werden getest in het Central Virology Laboratory van het Israëlische ministerie van Volksgezondheid met behulp van de HI-test volgens een standaard WHO-procedure 16. Sera werden gescheiden, van een code voorzien en bewaard bij -20°C totdat ze werden getest. Sera werden behandeld met receptorvernietigend enzym cholerafiltraat om niet-specifieke remmers te verwijderen, en met rode bloedcellen uit Turkije om niet-specifieke agglutininen te verwijderen. De behandelde sera werden getest met een HI-test tegen de drie antigenen die in het vaccin zijn opgenomen: A/California (CAL), B/Shangai (SHAN) en A/New Caledonia (NC). De werkverdunning (testdosis) van elk antigeen bevatte vier hemagglutinine-eenheden in 25 µl antigeen. Testdoses werden verdund in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en toegevoegd aan seriële verdunning van antiserum. De hemagglutinine-remmingstiter werd bepaald als de hoogste verdunning van serum die de hemagglutinatie van rode bloedcellen volledig remt.

De titer van een antiserum dat geen enkele remming vertoonde, werd geregistreerd als <10. Humorale respons werd gedefinieerd als een viervoudige of meer stijging van de titer, of een stijging vanaf een niet-beschermend basislijnniveau van <1/40 tot 1/40 in HI-antilichamen vier weken na vaccinatie 17,18. Geometrisch gemiddelde antilichaamtiters werden berekend om de immuniteit van de hele groep te beoordelen.

Primair eindpunt van de studie: het aandeel cellen dat interferon-gamma produceert bij patiënten met reumatoïde artritis en controles Secundair eindpunt: veiligheid van het vaccin