Resposta de Imunidade Celular à Vacinação Contra Influenza em Pacientes com Artrite Reumatoide

Sessenta pacientes com AR e 30 controles pareados e saudáveis ​​participarão do estudo.

Depois de assinar o consentimento informado, todos os indivíduos serão vacinados com a vacina de vírion dividido inativado, que será recomendada pela OMS no próximo outono.

Os pacientes serão avaliados no poço 0 e 6 semanas depois. A avaliação clínica será baseada na Pontuação de Atividade da Doença 28 (DAS 28), que inclui o número de articulações inchadas e sensíveis, avaliação visual global do médico, ESR e CRP Sangue a serem coletados no dia da vacinação e 6 semanas depois.

Preparação de células mononucleares de sangue periférico Serão obtidas amostras de sangue antes e 4 semanas após a vacinação. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) serão isoladas por centrifugação de sangue heparinizado em um gradiente Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Noruega). As células serão lavadas duas vezes em meio de cultura de tecidos RPMI (RPMI1640-Hepes com Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, EUA) e ressuspensas a uma concentração de 2 106/ml em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS ) (GIBCO BRL, NY, EUA).

Ensaio ELISPOT As placas de PVDF de 96 poços (difluoreto de polivinilideno, Millipore Corp., MA, EUA) serão pré-umedecidas com EtOH a 70%, depois revestidas com 100 l/poço de anticorpo monoclonal anti-IFN-humano (mAb) 1-D1K , diluído a 15 g/ml em solução salina tamponada com fosfato filtrada estéril (PBS) . As placas serão mantidas durante a noite a 4°C. Um total de 100.000 PBMC mais 5 l/poço (1 g/ml) de peptídeos serão adicionados a cada poço em duplicata para cada condição e incubados por 24 h a 37°C em 5% de CO2. Após a incubação, as placas serão lavadas com PBS e, em seguida, 100 l de mAb biotinilado (7-B6-1-biotina, Mabtech AB), diluído em PBS filtrado com 0,5% de FBS na concentração de 1 g/ml foram adicionados a cada poço. As placas serão incubadas 2 h em temperatura ambiente, lavadas com PBS e então incubadas com 100 l/poço de estreptavidina-fosfatase alcalina (Mabtech AB) diluída 1-1000 em PBS com 0,5% FBS por 1 h em temperatura ambiente. Após a lavagem, as células serão desenvolvidas adicionando 100 l/poço de substrato colorimétrico (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) e então contadas em um leitor ELISPOT. Cada mancha foi produzida por uma única célula formadora de manchas (SFC) de células T secretoras de IFN. Todos os testes foram realizados em duplicata e os valores médios foram calculados. Uma resposta será considerada positiva quando o número de pontos nos poços com células estimuladas por peptídeos, após a subtração do fundo (poços sem estimulação com peptídeo), for pelo menos duas vezes maior que o número de pontos de fundo14 e mais de 20/106 SFC.

Detecção da produção intracelular de citocinas por citometria de fluxo O método de coloração intracelular será utilizado para identificar o fenótipo de células T produtoras de INF ativadas por estimulação peptídica. A coloração será realizada utilizando o protocolo descrito por Rauser et al.15 As PBMC foram estimuladas por 6 h com 1 g/ml de peptídeos influenza. Brefeldin A (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) será adicionado nas últimas 4 h da incubação. Um controle positivo será obtido estimulando as células com 0,5 g/ml de PMA (Forbol 12-mirestato 13-acetato) e 1 g/ml de Ionomicina (ambos da Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). As células serão permeabilizadas e coradas com anticorpos anti-CD3, anti-CD4 ou anti-CD8 e anti-IFN- marcados com fluorocromo (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). As amostras serão analisadas por citometria de fluxo usando FACSCalibur (Becton Dickinson). O limite positivo para este teste foi de 0,05% de células T produtoras de IFN.

Proliferação de células CD4+ e CD8+ específicas A resposta celular será avaliada pela análise simultânea da proliferação de linfócitos T CD4+ e CD8+ específicos mediante estimulação com antígenos das três cepas de vírus presentes na vacina e produção de citocinas Th1 de ativação pelas mesmas células.

Resumidamente, para analisar simultaneamente a proliferação e a produção de citocinas por células T específicas para influenza, células mononucleares do sangue periférico serão obtidas em T0 e T1 de cada doador, coradas com o corante nuclear fluorescente carboxifluoresceína succinimidiléster (CFSE; Molecular Probes) e cultivadas em duplicata em a presença de peptídeos de HA de cada uma das cepas do vírus contidas na vacina do vírus influenza utilizada no estudo ou peptídeo controle por 72 h. Ao final da incubação, as culturas serão interrompidas com brefeldina, as células ressuspensas, coradas com anticorpos monoclonais anti-CD8 e anti-interferon-γ (IFN-γ) conjugados com fluorocromo (Becton&Dickinson) e analisadas por meio de um citômetro de fluxo de seis cores (FACSCanto-Becton&Dickinson) e software FACS DIVA. Como a cada divisão celular a fluorescência nuclear é reduzida pela metade, as células em proliferação caem nos quadrantes esquerdos do citograma, quanto mais divisões, menos fluorescência. As células produtoras de IFN-γ situam-se nos quadrantes superiores dos citogramas. As células que, após a estimulação do peptídeo influenza específico ou do peptídeo de controle, proliferam e produzem ativamente IFN-γ (citocina Th1) caem no quadrante superior esquerdo do citograma. Eles foram medidos como frequência (células em proliferação e produtoras de IFN-γ/total de linfócitos T CD4+ ou CD8+).

Teste de inibição da hemaglutinação A imunogenicidade da vacina foi testada pelo teste de inibição da hemaglutinação (HI).

O vírus influenza possui duas importantes glicoproteínas de superfície: a hemaglutinina (HA) e a neuraminidase (NA). A classificação antigênica e a subtipagem dos vírus influenza são baseadas nessas duas glicoproteínas. O HA desempenha um papel fundamental na entrada das células do vírus, ligando-se aos receptores da superfície celular, que também são encontrados nos glóbulos vermelhos de certas espécies. A ligação aos glóbulos vermelhos resulta em hemaglutinação, que pode ser observada como um tapete de glóbulos vermelhos aglutinados no fundo de um tubo ou poço de microtitulação. No teste HI, o anticorpo direcionado contra as hemaglutininas virais bloqueia a ligação do vírus às células sanguíneas e, portanto, inibe a reação de hemaglutinação.

Os anticorpos HI pré e pós-imunização foram testados no Laboratório Central de Virologia do Ministério da Saúde de Israel usando o teste HI de acordo com um procedimento padrão da OMS 16. Os soros foram separados, rotulados com código e armazenados a -20°C até serem testados. Os soros foram tratados com filtrado de cólera de enzima destruidora de receptores para remover inibidores não específicos e com glóbulos vermelhos de Turquia para remover aglutininas não específicas. Os soros tratados foram testados pelo teste HI contra os três antígenos incluídos na vacina: A/Califórnia (CAL), B/Shangai (SHAN) e A/Nova Caledônia (NC). A diluição de trabalho (dose teste) de cada antígeno continha quatro unidades de hemaglutinina em 25 µl de antígeno. As doses de teste foram diluídas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e adicionadas à diluição seriada do anti-soro. O título de inibição da hemaglutinina foi determinado como a maior diluição de soro que inibe completamente a hemaglutinação dos glóbulos vermelhos.

O título de um anti-soro que não apresenta nenhuma inibição foi registrado como <10. A resposta humoral foi definida como um aumento de quatro vezes ou mais no título, ou um aumento de um nível basal não protetor de <1/40 a 1/40 em anticorpos HI quatro semanas após a vacinação 17,18. Os títulos médios geométricos de anticorpos foram calculados para avaliar a imunidade de todo o grupo.

Ponto final primário do estudo: a proporção de células produtoras de Interferon gama em pacientes com artrite reumatóide e controles Ponto final secundário: Segurança da vacina