Celleimmunitetsrespons på vaksinasjon mot influensa hos pasienter med revmatoid artritt

Seksti pasienter med RA og 30 friske, gamle kontrollerte kontroller vil delta i studien.

Etter å ha signert informert samtykke, vil alle forsøkspersoner bli vaksinert med den inaktiverte splitt virion-vaksinen som vil bli anbefalt av WHO neste høst.

Pasientene vil bli evaluert ved første uke og 6 uker senere. Klinisk evaluering vil være basert på Disease Activity Score 28 (DAS 28) som inkluderer antall hovne og ømme ledd, visuell global evaluering av legen, ESR og CRP Blod som skal tas på vaksinasjonsdagen og 6 uker senere.

Klargjøring av mononukleære celler fra perifert blod Blodprøver vil bli tatt før og 4 uker etter vaksinasjon. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) vil bli isolert ved sentrifugering av heparinisert blod på en Lymphoprep-gradient (Nycomed, Oslo, Norge). Celler vil bli vasket to ganger i vevskulturmedium RPMI (RPMI1640-Hepes med Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, USA) og resuspendert til en konsentrasjon på 2 106/ml i RPMI 1640 supplert med 10 % varmeinaktivert føtalt bovint serum (FBS) ) (GIBCO BRL, NY, USA).

ELISPOT-analyse 96-brønners PVDF (polyvinylidendifluorid, Millipore Corp., MA, USA)-platene vil være forhåndsfukte med 70 % EtOH, deretter belagt med 100 l/brønn anti-humant IFN-monoklonalt antistoff (mAb) 1-D1K , fortynnet til 15 g/ml i sterilfiltrert fosfatbufret saltvann (PBS). Platene holdes over natten ved 4°C. Totalt 100 000 PBMC pluss 5 l/brønn (1 g/ml) peptider vil bli tilsatt til hver brønn i duplikat for hver tilstand og inkubert i 24 timer ved 37 °C i 5 % CO2. Etter inkubering vil platene vaskes med PBS, deretter ble 100 1 biotinylert mAb (7-B6-1-biotin, Mabtech AB), fortynnet i filtrert PBS med 0,5 % FBS til konsentrasjonen 1 g/ml tilsatt til hver brønn. Platene vil bli inkubert 2 timer ved romtemperatur, vasket med PBS og deretter inkubert med 100 l/brønn streptavidin-alkalisk fosfatase (Mabtech AB) fortynnet 1-1000 i PBS med 0,5 % FBS i 1 time ved romtemperatur. Etter vask vil cellene utvikles ved å tilsette 100 l/brønn kolorimetrisk substrat (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) og deretter telles i en ELISPOT-leser. Hver flekk ble produsert av en enkelt IFN-utskillende T-celle-flekk-dannende celle (SFC). Alle tester ble utført i duplikat og middelverdiene ble beregnet. En respons vil anses å være positiv når antall flekker i brønnene med peptidstimulerte celler, etter subtraksjon av bakgrunnen (brønner uten peptidstimulering), vil være minst to ganger større enn antall bakgrunnsflekker14 og mer enn 20/106 SFC.

Påvisning av intracellulær cytokinproduksjon ved flowcytometri Den intracellulære fargingsmetoden vil bli brukt for å identifisere fenotypen til INF-produserende T-celler aktivert ved peptidstimulering. Fargingen vil bli utført ved å bruke protokollen beskrevet av Rauser et al.15 PBMC ble stimulert i 6 timer med 1 g/ml influensapeptider. Brefeldin A (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) vil bli tilsatt de siste 4 timene av inkubasjonen. En positiv kontroll vil oppnås ved å stimulere cellene med 0,5 g/ml PMA (Phorbol 12-myrestat 13-acetat) og 1 g/ml Ionomycin (begge fra Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Cellene vil bli permeabilisert og farget med fluorokrom-merket anti-CD3, anti-CD4 eller anti-CD8 og anti-IFN-antistoffer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Prøver vil bli analysert ved flowcytometri ved bruk av FACSCalibur (Becton Dickinson). Den positive grensen for denne testen var 0,05 % av IFN-produserende T-celler.

Proliferasjon av spesifikk CD4+ og CD8+ Cellulær respons vil bli evaluert ved samtidig å analysere proliferasjon av spesifikke T CD4+ og CD8+ lymfocytter ved stimulering med antigener av de tre virusstammene som finnes i vaksinen og produksjon av aktiverings Th1 cytokiner av de samme cellene.

Kort fortalt, for samtidig å analysere proliferasjon og cytokinproduksjon av influensaspesifikke T-celler, vil perifert blod mononukleære celler oppnås ved T0 og T1 fra hver donor, farget med det fluorescerende kjernefargestoffet karboksyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE; Molecular Probes) og dyrket i duplikat. tilstedeværelsen av peptider av HA fra hver av virusstammene inneholdt i influensavirusvaksinen brukt i studien eller kontrollpeptidet i 72 timer. Ved slutten av inkubasjonen vil kulturer bli stoppet med brefeldin, cellene resuspendert, farget med fluorokrom-konjugerte anti-CD8 og anti-interferon-γ (IFN-γ) monoklonale antistoffer (Becton&Dickinson) og analysert ved hjelp av et seks-farget flow-cytometer (FACSCanto-Becton&Dickinson) og FACS DIVA programvare . Som ved hver celledeling halveres kjernefluorescensen, prolifererende celler faller i venstre kvadranter av cytogrammet, jo flere delinger jo mindre fluorescens. IFN-y-produserende celler faller i de øvre kvadrantene av cytogrammene. Celler som ved spesifikt influensapeptid eller kontrollerer peptidstimulering både prolifererer og produserer aktivt IFN-y (Th1 cytokin) faller i øvre venstre kvadrant av cytogrammet. De ble målt som frekvens (prolifererende og IFN-y-produserende celler/totale T CD4+ eller CD8+ lymfocytter).

Hemagglutinasjonshemmingstest Vaksinens immunogenisitet ble testet med hemagglutinasjonshemming (HI) test.

Influensavirus har to viktige overflateglykoproteiner: hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA). Antigen klassifisering og subtyping av influensavirus er basert på disse to glykoproteinene. HA spiller en nøkkelrolle i viruscelleinntrengning ved å binde seg til celleoverflatereseptorer, som også finnes på røde blodceller av visse arter. Binding til røde blodlegemer resulterer i hemagglutinasjon, som kan observeres som et teppe av agglutinerte røde blodlegemer i bunnen av et rør eller en mikrotiterbrønn. I HI-testen blokkerer antistoff rettet mot de virale hemagglutininene viruset fra å binde seg til blodcellene og hemmer dermed hemagglutinasjonsreaksjonen.

HI-antistoffene før og etter immunisering ble testet ved Central Virology Laboratory i det israelske helsedepartementet ved å bruke HI-testen i henhold til en standard WHO-prosedyre 16. Sera ble separert, kodemerket og lagret ved -20°C inntil testing. Sera ble behandlet med reseptorødeleggende enzymkolerafiltrat for å fjerne uspesifikke inhibitorer, og med røde blodceller fra Tyrkia for å fjerne uspesifikke agglutininer. De behandlede sera ble testet med HI-test mot de tre antigenene som er inkludert i vaksinen: A/California (CAL), B/Shangai (SHAN) og A/New Caledonia (NC). Arbeidsfortynningen (testdosen) av hvert antigen inneholdt fire hemagglutininenheter i 25 µl antigen. Testdoser ble fortynnet i fosfatbufret saltvann (PBS) og tilsatt seriefortynning av antiserum. Hemagglutinin-hemmingstiteren ble bestemt som den høyeste fortynningen av serum som fullstendig hemmer hemagglutinering av røde blodlegemer.

Titeren til et antiserum som ikke viste noen inhibering ble registrert som <10. Humoral respons ble definert som enten en fire ganger eller mer økning i titer, eller en økning fra et ikke-beskyttende baselinenivå på <1/40 til 1/40 i HI-antistoffer fire uker etter vaksinasjon 17,18. Geometriske gjennomsnittstitre av antistoff ble beregnet for å vurdere immuniteten til hele gruppen.

Primært endepunkt for studien: andelen celler som produserer interferon gamma hos pasienter med revmatoid artritt og kontroller Sekundært endepunkt: Vaksinens sikkerhet