Odpowiedź odporności komórkowej na szczepienie przeciwko grypie u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

W badaniu weźmie udział 60 pacjentów z RZS i 30 zdrowych, dopasowanych wiekowo osób z grupy kontrolnej.

Po podpisaniu świadomej zgody wszyscy uczestnicy zostaną zaszczepieni inaktywowaną szczepionką z rozszczepionym wirionem, która zostanie zarekomendowana przez WHO jesienią przyszłego roku.

Pacjenci będą oceniani w tygodniu 0 i 6 tygodni później. Ocena kliniczna będzie oparta na skali aktywności choroby 28 (DAS 28), która obejmuje liczbę obrzękniętych i bolesnych stawów, ogólną ocenę wzrokową lekarza, OB i CRP. Krew należy pobrać w dniu szczepienia i 6 tygodni później.

Przygotowanie jednojądrzastych komórek krwi obwodowej Próbki krwi zostaną pobrane przed i 4 tygodnie po szczepieniu. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zostaną wyizolowane przez odwirowanie heparynizowanej krwi na gradiencie Lymphoprep (Nycomed, Oslo, Norwegia). Komórki zostaną dwukrotnie przemyte w pożywce do hodowli tkankowej RPMI (RPMI1640-Hepes with Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, USA) i ponownie zawieszone do stężenia 2 x 106/ml w RPMI 1640 z dodatkiem 10% inaktywowanej cieplnie bydlęcej surowicy płodowej (FBS ) (GIBCO BRL, NY, USA).

Test ELISPOT 96-dołkowe płytki PVDF (polifluorek winylidenu, Millipore Corp., MA, USA) zostaną wstępnie zwilżone 70% EtOH, a następnie powleczone 100 µl/dołek przeciwciała monoklonalnego (mAb) przeciw ludzkiemu IFN-1-D1K, rozcieńczono do 15 ug/ml w sterylnie filtrowanej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Płytki będą trzymane przez noc w temperaturze 4°C. Łącznie 100 000 PBMC plus 5 µl/dołek (1 µg/ml) peptydów zostanie dodanych do każdego dołka w dwóch powtórzeniach dla każdych warunków i inkubowanych przez 24 godziny w 37°C w 5% CO2. Po inkubacji płytki przemyto PBS, a następnie do każdej studzienki dodano 100 ul biotynylowanego mAb (7-B6-1-biotyna, Mabtech AB), rozcieńczonego w filtrowanym PBS z 0,5% FBS do stężenia 1 ug/ml. Płytki będą inkubowane przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, przemyte PBS, a następnie inkubowane z 100 ul/studzienkę streptawidyno-alkalicznej fosfatazy (Mabtech AB) rozcieńczonej 1-1000 w PBS z 0,5% FBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu komórki będą rozwijane przez dodanie 100 ul/studzienkę substratu kolorymetrycznego (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB), a następnie zliczane w czytniku ELISPOT. Każda plamka była wytwarzana przez pojedynczą komórkę tworzącą plamkę (SFC) wydzielającą IFN. Wszystkie testy przeprowadzono w dwóch powtórzeniach i obliczono wartości średnie. Odpowiedź zostanie uznana za pozytywną, gdy liczba plamek w dołkach z komórkami stymulowanymi peptydem, po odjęciu tła (dołki bez stymulacji peptydem), będzie co najmniej dwukrotnie większa niż liczba plamek tła14 i więcej niż 20/106 SFC.

Wykrywanie wytwarzania cytokin wewnątrzkomórkowych za pomocą cytometrii przepływowej Metoda barwienia wewnątrzkomórkowego zostanie zastosowana do identyfikacji fenotypu komórek T wytwarzających INF, aktywowanych przez stymulację peptydem. Barwienie zostanie przeprowadzone zgodnie z protokołem opisanym przez Rausera i wsp.15 PBMC stymulowano przez 6 godzin 1 μg/ml peptydów grypy. Brefeldyna A (10 ug/ml, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) zostanie dodana na ostatnie 4 godziny inkubacji. Kontrola pozytywna zostanie uzyskana przez stymulację komórek 0,5 μg/ml PMA (13-octan 12-mirestynianu forbolu) i 1 μg/ml jonomycyny (oba z Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Komórki zostaną permeabilizowane i wybarwione znakowanymi fluorochromem przeciwciałami anty-CD3, anty-CD4 lub anty-CD8 i anty-IFN- (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Próbki będą analizowane metodą cytometrii przepływowej przy użyciu FACSCalibur (Becton Dickinson). Dodatnią granicą dla tego testu było 0,05% komórek T wytwarzających IFN.

Proliferacja swoistej odpowiedzi komórkowej CD4+ i CD8+ będzie oceniana poprzez jednoczesną analizę proliferacji swoistych limfocytów T CD4+ i CD8+ po stymulacji antygenami trzech szczepów wirusa obecnych w szczepionce i wytwarzaniu aktywujących cytokin Th1 przez te same komórki.

W skrócie, aby jednocześnie analizować proliferację i wytwarzanie cytokin przez limfocyty T specyficzne dla grypy, jednojądrzaste komórki krwi obwodowej zostaną uzyskane w T0 i T1 od każdego dawcy, wybarwione fluorescencyjnym barwnikiem jądrowym estru sukcynoimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE; sondy molekularne) i hodowane w dwóch powtórzeniach w obecność peptydów HA z każdego ze szczepów wirusa zawartych w szczepionce przeciwko wirusowi grypy zastosowanej w peptydzie badanym lub kontrolnym przez 72 godz. Na koniec inkubacji hodowle zostaną zatrzymane brefeldyną, komórki ponownie zawieszone, wybarwione skoniugowanymi z fluorochromem przeciwciałami monoklonalnymi anty-CD8 i anty-interferon-γ (IFN-γ) (Becton&Dickinson) i przeanalizowane za pomocą sześciokolorowego cytometru przepływowego (FACSCanto-Becton&Dickinson) oraz oprogramowanie FACS DIVA. Ponieważ przy każdym podziale komórki fluorescencja jądrowa zmniejsza się o połowę, proliferujące komórki spadają w lewe ćwiartki cytogramu, im więcej podziałów, tym mniejsza fluorescencja. Komórki wytwarzające IFN-γ mieszczą się w górnych ćwiartkach cytogramów. Komórki, które po stymulacji specyficznym peptydem grypy lub peptydem kontrolnym zarówno proliferują, jak i aktywnie wytwarzają IFN-γ (cytokinę Th1), znajdują się w lewym górnym kwadrancie cytogramu. Mierzono je jako częstość (komórki proliferujące i wytwarzające IFN-γ/całkowita liczba limfocytów T CD4+ lub CD8+).

Test hamowania hemaglutynacji Immunogenność szczepionki badano testem hamowania hemaglutynacji (HI).

Wirus grypy ma dwie ważne glikoproteiny powierzchniowe: hemaglutyninę (HA) i neuraminidazę (NA). Klasyfikacja antygenowa i podtypy wirusów grypy opierają się na tych dwóch glikoproteinach. HA odgrywa kluczową rolę we wnikaniu wirusa do komórki poprzez wiązanie się z receptorami na powierzchni komórki, które znajdują się również na krwinkach czerwonych niektórych gatunków. Wiązanie z krwinkami czerwonymi powoduje hemaglutynację, którą można zaobserwować jako dywan zlepionych krwinek czerwonych na dnie probówki lub studzienki do mikromiareczkowania. W teście HI przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyninom wirusowym blokują wiązanie się wirusa z komórkami krwi, a tym samym hamują reakcję hemaglutynacji.

Przeciwciała HI przed i po immunizacji były badane w Centralnym Laboratorium Wirusologicznym izraelskiego Ministerstwa Zdrowia przy użyciu testu HI zgodnie ze standardową procedurą WHO 16. Surowice oddzielono, oznaczono kodem i przechowywano w temperaturze -20°C do czasu przetestowania. Surowice traktowano przesączem z enzymu cholery niszczącego receptory w celu usunięcia nieswoistych inhibitorów oraz krwinkami czerwonymi indyka w celu usunięcia niespecyficznych aglutynin. Traktowane surowice testowano testem HI na trzy antygeny zawarte w szczepionce: A/California (CAL), B/Shangai (SHAN) i A/New Caledonia (NC). Rozcieńczenie robocze (dawka testowa) każdego antygenu zawierało cztery jednostki hemaglutyniny w 25 ul antygenu. Dawki testowe rozcieńczono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodano do seryjnego rozcieńczenia surowicy odpornościowej. Miano hamowania hemaglutyniny określono jako największe rozcieńczenie surowicy, które całkowicie hamuje hemaglutynację krwinek czerwonych.

Miano surowicy odpornościowej niewykazującej żadnego hamowania zapisano jako <10. Odpowiedź humoralną zdefiniowano jako czterokrotny lub większy wzrost miana przeciwciał lub wzrost miana przeciwciał przeciw HI z nieochronnego poziomu wyjściowego <1/40 do 1/40 cztery tygodnie po szczepieniu 17,18. Obliczono średnie geometryczne mian przeciwciał w celu oceny odporności całej grupy.

Pierwszorzędowy punkt końcowy badania: odsetek komórek wytwarzających interferon gamma u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów i grupy kontrolne. Drugorzędowy punkt końcowy: bezpieczeństwo szczepionki