Celleimmunitetsrespons på vaccination mod influenza hos patienter med reumatoid arthritis

Tres patienter med RA og 30 raske, alderen matchede kontroller vil deltage i undersøgelsen.

Efter at have underskrevet informeret samtykke vil alle forsøgspersoner blive vaccineret med den inaktiverede split virion-vaccine, som vil blive anbefalet af WHO næste efterår.

Patienterne vil blive evalueret ved 0. og 6. uger senere. Klinisk evaluering vil være baseret på Disease Activity Score 28 (DAS 28), som inkluderer antallet af hævede og ømme led, visuel global vurdering af lægen, ESR og CRP Blod, som skal indsamles på vaccinationsdagen og 6 uger senere.

Forberedelse af mononukleære celler fra perifert blod Blodprøver vil blive taget før og 4 uger efter vaccination. Perifere mononukleære blodceller (PBMC) vil blive isoleret ved centrifugering af hepariniseret blod på en Lymphoprep-gradient (Nycomed, Oslo, Norge). Celler vil blive vasket to gange i vævskulturmedium RPMI (RPMI1640-Hepes med Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, USA) og resuspenderet til en koncentration på 2 106/ml i RPMI 1640 suppleret med 10 % varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS) ) (GIBCO BRL, NY, USA).

ELISPOT-assay 96-brønds PVDF (polyvinylidendifluorid, Millipore Corp., MA, USA) pladerne vil blive forbefugtet med 70 % EtOH og derefter belagt med 100 l/brønd anti-humant IFN-monoklonalt antistof (mAb) 1-D1K , fortyndet til 15 g/ml i sterilfiltreret fosfatpufret saltvand (PBS). Pladerne vil blive opbevaret natten over ved 4°C. I alt 100.000 PBMC plus 5 l/brønd (1 g/ml) peptider vil blive tilsat til hver brønd i to eksemplarer for hver tilstand og inkuberet i 24 timer ved 37°C i 5% CO2. Efter inkubation vil pladerne blive vasket med PBS, hvorefter 100 l biotinyleret mAb (7-B6-1-biotin, Mabtech AB), fortyndet i filtreret PBS med 0,5 % FBS til koncentrationen 1 g/ml, blev tilsat til hver brønd. Pladerne vil blive inkuberet 2 timer ved stuetemperatur, vasket med PBS og derefter inkuberet med 100 l/brønd streptavidin-alkalisk phosphatase (Mabtech AB) fortyndet 1-1000 i PBS med 0,5 % FBS i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask vil cellerne blive udviklet ved at tilsætte 100 l/brønd kolorimetrisk substrat (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) og derefter tælles i en ELISPOT-læser. Hver plet blev produceret af en enkelt IFN-secernerende T-celle-plet-dannende celle (SFC). Alle test blev udført i to eksemplarer, og middelværdierne blev beregnet. Et svar vil blive betragtet som positivt, når antallet af pletter i brøndene med peptidstimulerede celler, efter subtraktion af baggrunden (brønde uden peptidstimulering), vil være mindst to gange større end antallet af baggrundspletter14 og mere end 20/106 SFC.

Påvisning af intracellulær cytokinproduktion ved flowcytometri Den intracellulære farvningsmetode vil blive brugt til at identificere fænotypen af ​​INF-producerende T-celler aktiveret ved peptidstimulering. Farvningen vil blive udført under anvendelse af protokollen beskrevet af Rauser et al.15 PBMC blev stimuleret i 6 timer med 1 g/ml influenzapeptider. Brefeldin A (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tilsættes i de sidste 4 timer af inkubationen. En positiv kontrol opnås ved at stimulere cellerne med 0,5 g/ml PMA (Phorbol 12-myrestat 13-acetat) og 1 g/ml Ionomycin (begge fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Cellerne vil blive permeabiliseret og farvet med fluorochrom-mærket anti-CD3, anti-CD4 eller anti-CD8 og anti-IFN-antistoffer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Prøver vil blive analyseret ved flowcytometri ved hjælp af FACSCalibur (Becton Dickinson). Den positive grænse for denne test var 0,05 % af IFN-producerende T-celler.

Proliferation af specifik CD4+ og CD8+ Cellulær respons vil blive evalueret ved samtidig at analysere proliferation af specifikke T CD4+ og CD8+ lymfocytter efter stimulering med antigener af de tre virusstammer, der er til stede i vaccinen og produktion af aktiverings Th1 cytokiner af de samme celler.

Kort fortalt, for samtidig at analysere proliferation og cytokinproduktion af influenzaspecifikke T-celler, vil perifere blodmononukleære celler blive opnået ved T0 og T1 fra hver donor, farvet med det fluorescerende nukleare farvestof carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE; Molecular Probes) og dyrket i duplikat tilstedeværelsen af ​​peptider af HA fra hver af virusstammerne indeholdt i influenzavirusvaccinen anvendt i undersøgelsen eller kontrolpeptidet i 72 timer. Ved afslutningen af ​​inkubationen stoppes kulturerne med brefeldin, cellerne resuspenderes, farves med fluorochrom-konjugerede anti-CD8 og anti-interferon-y (IFN-y) monoklonale antistoffer (Becton&Dickinson) og analyseres ved hjælp af et seks-farvet flow-cytometer (FACSanto-Becton&Dickinson) og FACS DIVA-software . Som ved hver celledeling halveres den nukleare fluorescens, prolifererende celler falder i cytogrammets venstre kvadranter, jo flere delinger, jo mindre fluorescens. IFN-y-producerende celler falder i de øvre kvadranter af cytogrammerne. Celler, der efter specifik influenzapeptid- eller kontrolpeptidstimulering både prolifererer og producerer aktivt IFN-y (Th1-cytokin), falder i den øverste venstre kvadrant af cytogrammet. De blev målt som frekvens (prolifererende og IFN-y-producerende celler/total T CD4+ eller CD8+ lymfocytter).

Hæmagglutinationshæmningstest Vaccinens immunogenicitet blev testet ved hæmagglutinationshæmningstest (HI).

Influenzavirus har to vigtige overfladeglykoproteiner: hæmagglutinin (HA) og neuraminidase (NA). Antigen klassificering og subtypebestemmelse af influenzavirus er baseret på disse to glykoproteiner. HA spiller en nøglerolle i viruscelleindtrængning ved at binde sig til celleoverfladereceptorer, som også findes på røde blodlegemer af visse arter. Binding til røde blodlegemer resulterer i hæmagglutination, som kan ses som et tæppe af agglutinerede røde blodlegemer i bunden af ​​et rør eller en mikrotiterbrønd. I HI-testen blokerer antistof rettet mod de virale hæmagglutininer virusets binding til blodcellerne og hæmmer dermed hæmagglutinationsreaktionen.

HI-antistofferne før og efter immunisering blev testet på det israelske sundhedsministeriums centrale virologiske laboratorium ved hjælp af HI-testen i henhold til en standard WHO-procedure 16. Sera blev adskilt, kodemærket og opbevaret ved -20°C indtil test. Sera blev behandlet med receptorødelæggende enzymkolerafiltrat for at fjerne ikke-specifikke inhibitorer og med røde blodlegemer fra Tyrkiet for at fjerne ikke-specifikke agglutininer. De behandlede sera blev testet ved HI-test mod de tre antigener inkluderet i vaccinen: A/California (CAL), B/Shangai (SHAN) og A/New Caledonia (NC). Arbejdsfortyndingen (testdosis) af hvert antigen indeholdt fire hæmagglutinin-enheder i 25 µl antigen. Testdoser blev fortyndet i phosphatbufret saltvand (PBS) og tilsat til seriefortynding af antiserum. Hæmagglutinin-hæmningstiteren blev bestemt som den højeste fortynding af serum, der fuldstændigt hæmmer hæmagglutination af røde blodlegemer.

Titeren af ​​et antiserum, der ikke viste nogen inhibering, blev registreret som <10. Humoral respons blev defineret som enten en fire gange eller mere stigning i titer eller en stigning fra et ikke-beskyttende baseline niveau på <1/40 til 1/40 i HI-antistoffer fire uger efter vaccination 17,18. Geometriske middeltitre af antistof blev beregnet for at vurdere immuniteten af ​​hele gruppen.

Undersøgelsens primære endepunkt: andelen af ​​celler, der producerer interferon gamma hos patienter med reumatoid arthritis og kontroller Sekundært endepunkt: vaccinens sikkerhed