Zellimmunantwort auf die Impfung gegen Influenza bei Patienten mit rheumatoider Arthritis

An der Studie werden sechzig Patienten mit RA und 30 gesunde, gleichaltrige Kontrollpersonen teilnehmen.

Nach Unterzeichnung der Einverständniserklärung werden alle Probanden mit dem inaktivierten Split-Virion-Impfstoff geimpft, der im nächsten Herbst von der WHO empfohlen wird.

Die Patienten werden in Woche 0 und 6 Wochen später untersucht. Die klinische Bewertung basiert auf dem Disease Activity Score 28 (DAS 28), der die Anzahl der geschwollenen und empfindlichen Gelenke, die visuelle Gesamtbewertung des Arztes, ESR und CRP umfasst Blut, das am Tag der Impfung und 6 Wochen später entnommen wird.

Vorbereitung von peripheren mononukleären Blutzellen Blutproben werden vor und 4 Wochen nach der Impfung entnommen. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) werden durch Zentrifugation von heparinisiertem Blut auf einem Lymphoprep-Gradienten (Nycomed, Oslo, Norwegen) isoliert. Die Zellen werden zweimal in Gewebekulturmedium RPMI (RPMI1640-Hepes mit Glutamax-I, GIBCO BRL, NY, USA) gewaschen und in RPMI 1640, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS ) (GIBCO BRL, NY, USA).

ELISPOT-Assay Die PVDF-Platten mit 96 Vertiefungen (Polyvinylidendifluorid, Millipore Corp., MA, USA) werden mit 70 % EtOH vorbenetzt und dann mit 100 l/Vertiefung monoklonalem Anti-Human-IFN-Antikörper (mAb) 1-D1K beschichtet. verdünnt auf 15 g/ml in sterilfiltrierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Die Platten werden über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Insgesamt 100.000 PBMC plus 5 l/Vertiefung (1 g/ml) Peptide werden in doppelter Ausführung für jede Bedingung in jede Vertiefung gegeben und für 24 h bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation werden die Platten mit PBS gewaschen, dann werden 100 &mgr;l biotinylierter mAb (7-B6-1-Biotin, Mabtech AB), verdünnt in filtrierter PBS mit 0,5 % FBS auf eine Konzentration von 1 g/ml, zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten werden 2 h bei Raumtemperatur inkubiert, mit PBS gewaschen und dann mit 100 l/Vertiefung Streptavidin-alkalische Phosphatase (Mabtech AB), 1-1000 verdünnt in PBS mit 0,5 % FBS, 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen werden die Zellen durch Zugabe von 100 l/Well kolorimetrischem Substrat (BCIP/NBT-plus, Mabtech AB) entwickelt und dann in einem ELISPOT-Lesegerät gezählt. Jeder Spot wurde von einer einzelnen IFN-sezernierenden T-Zell-Spot-bildenden Zelle (SFC) produziert. Alle Tests wurden doppelt durchgeführt und die Mittelwerte berechnet. Eine Reaktion gilt als positiv, wenn die Anzahl der Flecken in den Vertiefungen mit Peptid-stimulierten Zellen nach Abzug des Hintergrunds (Vertiefungen ohne Peptidstimulation) mindestens doppelt so groß ist wie die Anzahl der Hintergrundflecken14 und mehr als 20/106 SFC.

Nachweis der intrazellulären Zytokinproduktion durch Durchflusszytometrie Die intrazelluläre Färbemethode wird zur Identifizierung des Phänotyps von INF-produzierenden T-Zellen verwendet, die durch Peptidstimulation aktiviert werden. Die Färbung erfolgt nach dem von Rauser et al.15 beschriebenen Protokoll. PBMC wurden 6 h mit 1 g/ml Influenza-Peptiden stimuliert. Brefeldin A (10 g/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) wird für die letzten 4 h der Inkubation zugegeben. Eine positive Kontrolle wird erhalten, indem die Zellen mit 0,5 g/ml PMA (Phorbol 12-Myrestate 13-Acetat) und 1 g/ml Ionomycin (beide von Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) stimuliert werden. Die Zellen werden permeabilisiert und mit Fluorochrom-markierten Anti-CD3-, Anti-CD4- oder Anti-CD8- und Anti-IFN-Antikörpern (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) gefärbt. Die Proben werden durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von FACSCalibur (Becton Dickinson) analysiert. Die positive Grenze für diesen Test lag bei 0,05 % IFN-produzierender T-Zellen.

Die Proliferation spezifischer CD4+- und CD8+-Zellreaktionen wird durch gleichzeitige Analyse der Proliferation spezifischer T-CD4+- und -CD8+-Lymphozyten nach Stimulierung mit Antigenen der drei im Impfstoff vorhandenen Virusstämme und der Produktion aktivierender Th1-Zytokine durch dieselben Zellen bewertet.

Kurz gesagt, um die Proliferation und Zytokinproduktion durch Influenza-spezifische T-Zellen gleichzeitig zu analysieren, werden periphere mononukleäre Blutzellen bei T0 und T1 von jedem Spender erhalten, mit dem fluoreszierenden Kernfarbstoff Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE; Molecular Probes) gefärbt und in zweifacher Ausfertigung kultiviert das Vorhandensein von HA-Peptiden von jedem der Virusstämme, die in dem in der Studie verwendeten Influenzavirus-Impfstoff oder Kontrollpeptid für 72 h enthalten sind. Am Ende der Inkubation werden die Kulturen mit Brefeldin gestoppt, die Zellen resuspendiert, mit Fluorochrom-konjugierten monoklonalen Anti-CD8- und Anti-Interferon-γ (IFN-γ)-Antikörpern (Becton&Dickinson) gefärbt und mittels eines Sechsfarben-Durchflusszytometers analysiert (FACSCanto-Becton&Dickinson) und FACS DIVA-Software. Da bei jeder Zellteilung die Kernfluoreszenz halbiert wird, fallen proliferierende Zellen in die linken Quadranten des Zytogramms, je mehr Teilungen desto weniger Fluoreszenz. IFN-γ produzierende Zellen fallen in die oberen Quadranten der Zytogramme. Zellen, die nach Stimulation mit einem spezifischen Influenzapeptid oder Kontrollpeptid sowohl proliferieren als auch aktiv IFN-γ (Th1-Zytokin) produzieren, fallen in den oberen linken Quadranten des Zytogramms. Sie wurden als Häufigkeit (proliferierende und IFN-γ-produzierende Zellen/Gesamt-T CD4+ oder CD8+ Lymphozyten) gemessen.

Hämagglutinations-Hemmungstest Die Immunogenität des Impfstoffs wurde durch einen Hämagglutinations-Hemmungstest (HI) getestet.

Das Influenzavirus hat zwei wichtige Oberflächenglykoproteine: das Hämagglutinin (HA) und die Neuraminidase (NA). Die antigene Klassifizierung und Subtypisierung von Influenzaviren basiert auf diesen beiden Glykoproteinen. HA spielt eine Schlüsselrolle beim Eindringen in Viruszellen, indem es an Zelloberflächenrezeptoren bindet, die auch auf roten Blutkörperchen bestimmter Arten zu finden sind. Die Bindung an Erythrozyten führt zu einer Hämagglutination, die als Teppich agglutinierter Erythrozyten am Boden eines Röhrchens oder einer Mikrotitervertiefung beobachtet werden kann. Beim HI-Test blockieren gegen die viralen Hämagglutinine gerichtete Antikörper die Virusbindung an die Blutzellen und hemmen so die Hämagglutinationsreaktion.

Die HI-Antikörper vor und nach der Immunisierung wurden im zentralen Virologielabor des israelischen Gesundheitsministeriums mit dem HI-Test gemäß einem Standardverfahren der WHO getestet 16. Die Seren wurden getrennt, mit einem Code versehen und bis zum Testen bei –20°C gelagert. Die Seren wurden mit Cholera-Filtrat des rezeptorzerstörenden Enzyms behandelt, um unspezifische Inhibitoren zu entfernen, und mit roten Blutkörperchen aus der Türkei, um unspezifische Agglutinine zu entfernen. Die behandelten Seren wurden mittels HI-Test gegen die drei im Impfstoff enthaltenen Antigene getestet: A/Kalifornien (CAL), B/Shangai (SHAN) und A/Neukaledonien (NC). Die Arbeitsverdünnung (Testdosis) jedes Antigens enthielt vier Hämagglutinin-Einheiten in 25 µl Antigen. Testdosen wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und zu einer Reihenverdünnung von Antiserum gegeben. Der Titer der Hämagglutinin-Hemmung wurde als die höchste Serumverdünnung bestimmt, die die Hämagglutinierung der roten Blutkörperchen vollständig hemmt.

Der Titer eines Antiserums, das keine Hemmung zeigte, wurde als < 10 aufgezeichnet. Die humorale Reaktion wurde entweder als vierfacher oder höherer Anstieg des Titers oder als ein Anstieg von einem nicht schützenden Ausgangswert von <1/40 auf 1/40 der HI-Antikörper vier Wochen nach der Impfung definiert 17,18. Geometrische mittlere Antikörpertiter wurden berechnet, um die Immunität der gesamten Gruppe zu beurteilen.

Primärer Endpunkt der Studie: Anteil der Zellen, die Interferon-Gamma produzieren, bei Patienten mit rheumatoider Arthritis und Kontrollen. Sekundärer Endpunkt: Sicherheit des Impfstoffs