過敏性腸症候群におけるプロバイオティクス細菌による内臓過敏症の操作

バックグラウンド

過敏性腸症候群 (IBS) の根底にあるメカニズムの不完全な理解は、この状態の効果的な治療法の開発を妨げています。 これは、人口の少なくとも 20% に影響を与え (1)、患者の生活の質 (QOL) に大きな影響を与える状態 (2) に対しては、長い間延期されています。 2 つのレベル: ストレス、感情、および心理的状態のすべてが IBS 症状の認識をどのように変化させるかという概念を提供する脳腸軸。 腸壁内では、IBS に関係する病態生理学的メカニズムには、感染、免疫活性化、運動障害、異常発酵、および内臓過敏症が含まれます。 研究によると、ストレスに反応した内臓痛の閾値は、健康なボランティアと比較して IBS 患者の方が低いことが示されています (3)。 この過敏症は、物理的および化学的刺激の両方に反応して明らかですが、内臓過敏症の引き金はほとんど知られていません。 腸内細菌は、IBS の誘発に重要な役割を果たします。 例えば、感染後 IBS は、胃腸炎の発作後の患者のサブグループで発生しました (4)。 共生微生物叢の操作は IBS 症状を軽減することができ、特定のビフィズス菌を含むプロバイオティクス製剤が特に効果的である可能性があるといういくつかの証拠があります (5)。 この提案は、内臓過敏症の根底にあるメカニズムのさらなる調査に焦点を当て、プロバイオティクス製剤による治療の将来のターゲティングを指示します.

目的 この研究の目的は、(i) 腸内細菌叢における IBS 関連の変化を特定することです。 (ii) SERT 発現とジェノタイピング、および腸内微生物叢との関係を研究すること、および (iii) プロバイオティクス療法が IBS 患者の内臓感受性を変化させるかどうか、および内臓過敏症のプロバイオティクスによる変化が腸内微生物叢の変化と関連しているかどうかを判断すること.

仮説 研究者らは、内臓感覚に必要な感覚求心性シグナル伝達とセロトニンシグナル伝達を細菌が調節し、これらの経路がプロバイオティクス細菌を使用した IBS の治療の標的となり得ると仮定しています。

調査計画 この調査は 2 つの部分で構成されています。 最初の部分は、IBS 患者と健常対照者の結腸微生物叢と SERT 発現を比較する横断研究です。 2番目の部分では、IBS患者の内臓過敏症、SERT発現、および粘膜微生物叢における経口プロバイオティクス細菌の影響を評価するためのパイロット非盲検試験が含まれます.

ベースライン来院 ＩＢＳ患者１０名を外来診療所から募集する。 疾患の重症度は、登録時に検証済みの IBS 症状アンケートで決定されます。 全血球計算、生化学プロファイル、C反応性タンパク質などの定期的な血液検査が行われます。 圧力および痛みに対する直腸の感受性は、バロスタット装置で評価されます。 バロスタット装置は、内臓過敏症の測定として他の多くの研究で使用されています。 両方のテストのための機器は、現在私たちの研究室で使用されています。 ベースラインの大腸内視鏡検査が実施され、直腸生検が行われます。 ポリープまたは結腸直腸癌のスクリーニング結腸内視鏡検査を受け、その後正常な結腸内視鏡検査を受けることが判明した 10 人の対照が、FGI-Bx 研究に参加するために含まれ、その組織サンプルがこの研究で使用されます。

IBS からのベースライン サンプル:

1 直腸組織 (組織学用に固定されたホルマリン) 2 直腸組織 (SERT 多型) 3 直腸組織 (粘膜微生物叢) EDTA チューブ内の 5ml の血液 (SERT 多型)

コントロールからのサンプル:

1 直腸組織 (組織学用に固定されたホルマリン) 2 直腸組織 (SERT 多型) 3 直腸組織 (粘膜微生物叢) EDTA チューブ内の 5ml の血液 (SERT 多型)

介入 IBS 患者は、VSL#3 (4,500 億個の凍結乾燥細菌/サシェ) を 1 日 2 回、4 週間受けます。 VSL#3 がこの研究で使用するために選択されたのは、(a) 3 つの異なるビフィズス菌株 (乳酸桿菌と連鎖球菌に加えて) が含まれており、ビフィズス菌が IBS で最も効果的なプロバイオティクスとして入手できる証拠が限られている (13) ためです。 調査のフローチャートは付録 1 にあります。

第 4 週の評価

プロバイオティクス療法に対する臨床反応 評価は、ベースライン時および療法の 28 日目に行われます。 IBS の 3 つの症状は、治療への反応を判断するために評価されます: 腹痛/不快感、膨満感/膨満感、排便。最大スコア 100)。 3 つの主要な症状の合計を含む複合スコアも各患者について計算されます (リッカート スケールの最大スコア 21) (VAS; 最大スコア 300)。 直腸感受性試験を繰り返す。

プロバイオティクス療法に反応した粘膜微生物叢の変化 評価は、ベースライン時および 28 日目に行われます。 反復結腸内視鏡検査のやや侵襲的な性質のため、研究者は、プロバイオティクス治療後に直腸生検を得るために柔軟な S 状結腸鏡検査のみを実行します。

IBS からの第 4 週のサンプル:

1. 直腸組織 (組織学用に固定されたホルマリン)
2. 直腸組織 (SERT 多型)
3. 直腸組織（粘膜微生物叢）

EDTA 中 5ml の血液 (SERT 多型)

6 か月のフォローアップ 患者は 6 か月後に連絡を受け、症状スコアを再評価して治療の長期的な影響を判断します。

COLONOSCOPY 結腸内視鏡検査は、静脈内ジアゼパムとペチジンによる意識下鎮静下で、外来処置として行われます。 被験者はPEGで腸の準備を受けます。 柔軟な S 状結腸内視鏡検査の場合、事前準備なしの検査が行われ、肛門縁から 15 cm の位置で 4 つの生検が行われます。

直腸バロスタット バロスタット装置には、固定された時間差とバッグ圧力増分でバルーンの膨張を自動的に実行するようにプログラムできる組み込みのコンピューターシステムが含まれています。 一定圧でのバルーン容積の変化は、内臓壁の緊張とコンプライアンスの変化を反映しています。 さらに、バルーン内圧のプログラムされた変動により、被験者の感覚閾値を評価することができます。

患者は、直腸洗浄のために自宅で勉強する 4 時間前に、4.5 液量オンスのリン酸ナトリウムを直腸に投与するように指示されます。 3時間の断食の後、参加者は左側臥位になります。 バロスタットバッグが直腸に挿入されます。 バロスタット デバイスは、低コンプライアンス PVC チューブを使用してバロスタット カテーテルに接続されます。

10 分間安静にした後、4 mm Hg (40 秒間) ずつ連続的に増分し、断続的なバッグの収縮 (40 秒間) を交互に行う、昇順限界法 (AML) プロトコルを使用して、位相性等圧直腸拡張を自動的に実行します。 各膨張段階で、参加者は次のスケールでバロスタット デバイスの知覚パネルを押して知覚評価を報告するように要求されます: (1) バルーン膨張の感覚なし、(2) バルーン膨張の最初の感覚、(3)排便への欲求、(4) 許容できる最大の感覚。 痛みまたは最大の許容可能な感覚が報告された場合、処置は中止されます。 感覚閾値は、バルーン膨張の最初の感覚を呼び起こすバッグ圧力の下限として定義されます。 痛みの閾値は、「痛み」反応または最大許容感覚を誘発する圧力として定義されます。

MUCOSAL MICROBIOTA 結腸のサンプルを採取して、付着細菌叢を表します。 すべてのサンプルは、使用するまで摂氏-80度で保存されます。 各サンプルを、500μlのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(24:24:1)、および500μlの直径0.1mmのジルコニア/シリカビーズ(Biospec Products、Barthesville、OK)を含むチューブに追加します。 微生物細胞は、ビーズビーター (Biospec Products、2 分間高に設定された器具) を使用して摂氏 23 度で機械的に破壊されます。 単離されたＤＮＡは、１％アガロースゲルを介した電気泳動によって分画され、支配的なバンドは、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製される。

パイロシーケンシングのための細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ配列の増幅は、ＰＣＲによって行われる。 各サンプルについて、細菌16s rRNA遺伝子の保存領域にアニールするプライマーBSR357-AおよびBSF8-Bを使用して、100～200mgの精製ゲノムDNAを増幅します。 PCR産物は、454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLXシステム（CUHK理学部提供）を使用して配列決定されます。 品質管理は次の基準によって達成されます: 配列は、(i) バーコードおよび 16S リボソーム RNA 遺伝子プライマーと完全に一致すること、(ii) 長さが少なくとも 50 ヌクレオチドであること、(iii) 2 つ以下であること配列読み取り中の未決定の塩基、および (iv) 以前に決定された 16S リボソーム RNA 遺伝子配列と少なくとも 75% 一致する。 運用分類単位 (OTU) のクラスタリングと分析は、OTUPicker を使用して実行されます。 クラスタリングと主座標分析は、UniFrac を使用して実行されます。 パイロシーケンシングのエラーはわずか 0.25% の割合で発生するため、フィルタリング後に残る 400 ヌクレオチド シーケンスのほとんどには、0 または 1 つのエラーが含まれます。 このレベルのシーケンス エラーは、分類学的分析には影響しません。

結腸微生物分類解析の最終データセットは、1,358,426 配列のリボソーム データベース プロジェクト リリース 10 と比較されます。

セロトニントランスポーターの多形性 ジェノタイピングのために、標準的なフェノール/クロロホルム抽出により、血小板 (静脈血から) および結腸生検から DNA を分離します。

プロモーター領域 (SERT-P) の 44 bp の挿入/欠失多型は、フォワードプライマー 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' およびリバースプライマー 5'-GGC GTT を使用したサンプル DNA の PCR によって分析されます。 GCC GCT CTG AAT GC-3'. 予想される製品サイズは、それぞれ、欠失 (s) で 484 bp、挿入 (l) で 528 bp です。

SERT 遺伝子イントロン 2 の 17 bp VNTR 多型は、フォワードプライマー 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' およびリバースプライマー 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 を使用したサンプル DNA の PCR によって研究されます。 '。 対立遺伝子 9、10、11、および 12 の予想される製品サイズは、それぞれ 253bp、270bp、287bp、および 304bp です。

結腸および血小板のSERTタンパク質の発現も、リアルタイムPCRおよびウエスタンブロット法によって研究されます。