Manipulering av visceral överkänslighet med probiotiska bakterier vid Irritable Bowel Syndrome

Bakgrund

En ofullständig förståelse av mekanismerna bakom irritabel tarmsyndrom (IBS) har hindrat utvecklingen av en effektiv terapi för detta tillstånd. Detta är sedan länge väntat för ett tillstånd som drabbar minst 20 procent av befolkningen (1), och som har stor inverkan på patientens livskvalitet (2). två nivåer: hjärnan-tarmaxeln som ger en uppfattning om hur stress, känslor och psykologiska tillstånd alla förändrar uppfattningen av IBS-symtom. Inom tarmväggen inkluderar de patofysiologiska mekanismer som är inblandade i IBS infektion, immunaktivering, dysmotilitet, onormal fermentering och visceral överkänslighet. Studier har visat att viscerala smärttrösklar som svar på stress är lägre hos patienter med IBS jämfört med friska frivilliga (3). Denna överkänslighet är uppenbar som svar på både en fysikalisk och kemisk stimulans, men triggerna till visceral överkänslighet förblir i stort sett okända. tarmbakterier spelar en betydande roll för att inducera IBS. Till exempel post-infektiös IBS utvecklats i en undergrupp av patienter efter ett anfall av gastroenterit (4). Manipulering av den kommensala mikrobiotan kan lindra IBS-symtom och det finns vissa bevis för att probiotiska preparat som innehåller vissa bifidobakterier kan vara särskilt effektiva (5). Detta förslag kommer att fokusera på ytterligare utforskning av mekanismerna bakom visceral överkänslighet för direkt framtida inriktning av terapi med probiotiska preparat.

Syfte Syftet med denna studie är (i) att identifiera IBS-associerade förändringar i tarmmikrobiota; (ii) för att studera SERT-uttryck och genotypning, och deras förhållande till tarmmikrobiotan, och (iii) för att avgöra om probiotisk terapi förändrar visceral känslighet hos IBS-patienter och om probiotika-inducerade förändringar i visceral överkänslighet är associerade med förändringar i tarmmikrobiotan .

Hypotes Utredarna postulerar att bakterier modulerar sensorisk afferent signalering och serotoninsignalering, vilket är nödvändigt för visceral känsla och att dessa vägar kan riktas mot IBS-behandling med probiotiska bakterier.

FORSKNINGSPLAN Denna studie består av två delar. Den första delen kommer att vara en tvärsnittsstudie som jämför kolonmikrobiota och SERT-uttryck hos IBS-patienter och friska kontroller. Den andra delen kommer att involvera en öppen pilotstudie för att bedöma effekterna av orala probiotiska bakterier vid visceral överkänslighet, SERT-uttryck och mukosal mikrobiota hos patienter med IBS.

Baslinjebesök Tio patienter med IBS kommer att rekryteras från öppenvårdsmottagningar. Sjukdomens svårighetsgrad kommer att fastställas vid inskrivningen med ett validerat IBS-symtomenkät. Rutinmässiga blodprov inklusive fullständigt blodvärde, biokemiprofil och C-reaktivt protein kommer att erhållas. Rektal känslighet för tryck och smärta kommer att bedömas med Barostat-apparat. Barostatapparat har använts i många andra studier som ett mått på visceral överkänslighet. Utrustning för båda testerna används för närvarande på vårt laboratorium. En baslinjekoloskopi kommer att utföras och rektala biopsier kommer att tas. Tio kontroller som genomgår screeningkoloskopi för polyper eller kolorektal cancer och som därefter visar sig ha en normal koloskopi kommer att inkluderas för att delta i FGI-Bx-studien, där deras vävnadsprover skulle användas i denna studie.

Baslinjeprover från IBS:

1 rektalvävnad (formalin fixerad för histologi) 2 rektalvävnad (SERT-polymorfism) 3 rektalvävnad (slemhinnemikrobiota) 5 ml blod i EDTA-rör (SERT-polymorfism)

Prover från kontroller:

1 rektalvävnad (formalin fixerad för histologi) 2 rektalvävnad (SERT-polymorfism) 3 rektalvävnad (slemhinnemikrobiota) 5 ml blod i EDTA-rör (SERT-polymorfism)

Intervention IBS-patienter kommer att få VSL#3 (450 miljarder lyofiliserade bakterier/påse) två gånger dagligen i 4 veckor. VSL#3 valdes ut för användning i denna studie eftersom (a) den innehåller tre olika Bifidobacteria-stammar (utöver laktobaciller och streptokocker) och det begränsade beviset som finns tillgängligt Bifidobacteria som de mest effektiva probiotika vid IBS (13). Ett flödesschema över studien finns i bilaga 1.

Vecka 4 Bedömning

Kliniskt svar på probiotisk behandling Bedömningar kommer att göras vid baslinjen och på dag 28 av behandlingen. De tre symtomen på IBS kommer att bedömas för att bestämma svaret på terapin: buksmärta/obehag, uppblåsthet/utspändhet och tarmrörelser, var och en poängsatt på en ordinarie skala (Likert-skala; maximal poäng 7) och på en 100 mm visuell analog skala (VAS; maxpoäng 100). En sammansatt poäng med summan av de 3 kardinalsymtomen kommer också att beräknas för varje patient (Likert-skalan maximal poäng 21) (VAS; maximal poäng 300). Upprepad rektal känslighetstest kommer att utföras.

Förändringar i slemhinnemikrobiota som svar på probiotisk terapi Bedömningar kommer att göras vid baslinjen och på dag 28. På grund av den något invasiva karaktären hos en upprepad koloskopi, kommer utredarna endast att utföra en flexibel sigmoidoskopi för att erhålla rektala biopsier efter probiotisk behandling.

Vecka 4 prover från IBS:

1. rektal vävnad (formalin fixerad för histologi)
2. rektala vävnader (SERT polymorfism)
3. rektala vävnader (slemhinnemikrobiota)

5 ml blod i EDTA (SERT polymorfism)

Sex månaders uppföljning Patienterna kommer att kontaktas efter 6 månader för att omvärdera symtompoängen för att fastställa den långsiktiga effekten av behandlingen.

KOLONOSKOPI Koloskopi kommer att utföras som ett polikliniskt ingrepp under medveten sedering med intravenös diazepam och petidin. Försökspersonerna kommer att få tarmförberedelser med PEG. För flexibel sigmoidoskopi görs en oförberedd undersökning och fyra biopsier tas 15 cm från analkanten.

RECTAL BAROSTAT Barostatenheten innehåller ett inbyggt datorsystem som kan programmeras för att automatiskt utföra utvidgning av ballongen med fasta tidsfördröjningar och påstrycksteg. Variation i ballongvolym i ett konstant tryck återspeglar förändringen i ton och följsamhet hos den viscerala väggen. Dessutom, genom en programmerad variation i intraballongtrycket, kan patientens sensoriska tröskel utvärderas.

Patienten instrueras att administrera 4,5 fl oz natriumfosfater rektalt 4 timmar före studien hemma för rektal rengöring. Efter en 3-timmars fasta kommer deltagaren att placeras i vänster sidoläge. En barostatpåse förs in i ändtarmen. Barostatanordningen är ansluten till barostatkatetern med hjälp av en PVC-slang med låg eftergivlighet.

Efter 10 minuters vila utförs fasiska isobariska rektala utvidgningar automatiskt med användning av AML-protokollet (ascending method of limits) med successiva ökningar på 4 mm Hg (40 sekunders varaktighet) alternerande med intermittenta perioder av tömning av påsen (40 sekunder). Under varje utvidgningsfas uppmanas deltagaren att rapportera uppfattningsvärdena genom att trycka på perceptionspanelen på barostatenheten med följande skala: (1) Ingen känsla av ballongutvidgning, (2) den första känslan av ballongutvidgning, (3) önskan om avföring, (4) maximal tolererbar känsla. Proceduren kommer att avbrytas när smärta eller maximal tolererbar känsla rapporteras. Den sensoriska tröskeln definieras som den nedre gränsen för påstrycket som framkallar den första känslan av ballongutvidgning. Smärttröskeln definieras som tryck som framkallar ett "smärtsvar" eller maximal tolererbar känsla.

MUCOSAL MICROBIOTA Kolonprover kommer att tas för att representera adherent bakterieflora. Alla prover kommer att förvaras vid -80 grader Celsius fram till användning. Varje prov kommer att läggas till rör som innehåller 500 µl fenol: Kloroform: isoamylalkohol (24:24:1) och 500 µl 0,1 mm diameter zirkoniumoxid/kiseldioxidpärlor (Biospec Products, Barthesville, OK). Mikrobiella celler kommer att störas mekaniskt vid 23 grader Celsius med en pärlvisp (Biospec Products, instrument inställt på högt i 2 minuter). Isolerat DNA kommer att fraktioneras genom elektrofores genom 1% agarosgeler, och det dominerande bandet kommer att renas med MiniElute Gel Extraction Kit (Qiagen).

Amplifiering av de bakteriella 16S ribosomala RNA-sekvenserna för pyrosekvensering kommer att utföras med PCR. För varje prov kommer 100-200 mg renat genomiskt DNA att amplifieras genom att använda primers BSR357-A och BSF8-B, som hybridiserar till konserverade regioner av bakteriell 16s rRNA-gen. PCR-produkterna kommer att sekvenseras med hjälp av 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX-systemet (tillhandahålls av Naturvetenskapliga fakulteten, CUHK). Kvalitetskontroll kommer att uppnås genom följande kriterier: sekvensen ska (i) visa en perfekt matchning med streckkoden och 16S ribosomala RNA-genprimer, (ii) vara minst 50 nukleotider lång, (iii) inte ha mer än två obestämda baser i den avlästa sekvensen, och (iv) har minst 75 % matchning med en tidigare bestämd 16S ribosomal RNA-gensekvens. Operationell taxonomic unit (OTU) klustring och analys kommer att utföras med hjälp av OTUPicker. Klustring och principiell koordinatanalys kommer att utföras med UniFrac. Eftersom fel i pyrosekvensering inträffar med en hastighet av endast 0,25 %, kommer de flesta av de 400-nukleotidsekvenser som finns kvar efter filtrering att innehålla antingen 0 eller 1 fel. Denna nivå av sekvenseringsfel kommer inte att påverka den taxonomiska analysen.

Den slutliga datamängden för kolonmikrobiell taxonomisk analys kommer att jämföras med Ribosomal Database Project Release 10 med 1 358 426 sekvenser.

SEROTONIN TRANSPORTER POLYMORFIS För genotypning kommer DNA att isoleras från blodplättar (från venöst blod) och kolonbiopsier genom standardfenol/kloroformextraktion.

44-bp insättnings-/deletionspolymorfismen i promotorregionen (SERT-P) kommer att analyseras med PCR av prov-DNA med framåtriktad primer 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' och omvänd primer 5'-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3'. De förväntade produktstorlekarna är 484 bp för deletion (s) respektive 528 bp för insättning (l).

17-bp VNTR-polymorfismen av SERT-genintron 2 kommer att studeras genom PCR av prov-DNA med framåtriktad primer 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' och omvänd primer 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. De förväntade produktstorlekarna för allelerna 9, 10, 11 och 12 är 253bp, 270bp, 287bp respektive 304bp.

Kolon- och blodplätts-SERT-proteinuttrycken kommer också att studeras med realtids-PCR och western blot-metoden.