Manipulation der viszeralen Überempfindlichkeit mit probiotischen Bakterien beim Reizdarmsyndrom

Hintergrund

Ein unvollständiges Verständnis der Mechanismen, die dem Reizdarmsyndrom (IBS) zugrunde liegen, hat die Entwicklung einer wirksamen Therapie für diese Erkrankung behindert. Dies ist längst überfällig für eine Erkrankung, die mindestens 20 Prozent der Bevölkerung betrifft (1) und einen großen Einfluss auf die Lebensqualität (QOL) des Patienten hat (2). Im Mittelpunkt steht das aktuelle Verständnis der zugrunde liegenden Ätiologie und Pathogenese von IBS zwei Ebenen: die Gehirn-Darm-Achse, die ein Konzept dafür liefert, wie Stress, Emotionen und psychische Zustände die Wahrnehmung von IBS-Symptomen verändern. Innerhalb der Darmwand umfassen die pathophysiologischen Mechanismen, die an IBS beteiligt sind, Infektion, Immunaktivierung, Dysmotilität, abnormale Gärung und viszerale Überempfindlichkeit. Studien haben gezeigt, dass die viszeralen Schmerzschwellen als Reaktion auf Stress bei Patienten mit Reizdarmsyndrom niedriger sind als bei gesunden Probanden (3). Diese Überempfindlichkeit zeigt sich als Reaktion sowohl auf einen physikalischen als auch auf einen chemischen Reiz, aber die Auslöser der viszeralen Überempfindlichkeit bleiben weitgehend unbekannt. Darmbakterien spielen eine bedeutende Rolle bei der Auslösung von Reizdarmsyndrom. Zum Beispiel entwickelte sich postinfektiöses Reizdarmsyndrom in einer Untergruppe von Patienten nach einem Anfall von Gastroenteritis (4). Die Manipulation der kommensalen Mikrobiota kann IBS-Symptome lindern, und es gibt Hinweise darauf, dass probiotische Präparate, die bestimmte Bifidobakterien enthalten, besonders wirksam sein können (5). Dieser Vorschlag konzentriert sich auf die weitere Erforschung der Mechanismen, die der viszeralen Überempfindlichkeit zugrunde liegen, um eine zukünftige gezielte Therapie mit probiotischen Präparaten zu ermöglichen.

Ziele Die Ziele dieser Studie sind (i) IBS-assoziierte Veränderungen in der Darmmikrobiota zu identifizieren; (ii) Untersuchung der SERT-Expression und -Genotypisierung und ihrer Beziehung zur Darmmikrobiota und (iii) Bestimmung, ob die probiotische Therapie die viszerale Empfindlichkeit bei IBS-Patienten verändert und ob probiotikainduzierte Veränderungen der viszeralen Überempfindlichkeit mit Veränderungen der Darmmikrobiota verbunden sind .

Hypothese Die Forscher postulieren, dass Bakterien die sensorische afferente Signalübertragung und die Serotonin-Signalübertragung modulieren, die für die viszerale Empfindung notwendig sind, und dass diese Signalwege für die Therapie von IBS unter Verwendung von probiotischen Bakterien anvisiert werden können.

FORSCHUNGSPLAN Diese Studie besteht aus zwei Teilen. Der erste Teil wird eine Querschnittsstudie sein, die die Kolon-Mikrobiota und die SERT-Expression bei IBS-Patienten und gesunden Kontrollpersonen vergleicht. Der zweite Teil wird eine offene Pilotstudie umfassen, um die Auswirkungen von oralen probiotischen Bakterien auf viszerale Überempfindlichkeit, SERT-Expression und Schleimhautmikrobiota bei Patienten mit IBS zu bewerten.

Baseline-Besuch Zehn Probanden mit IBS werden aus Ambulanzen rekrutiert. Der Schweregrad der Erkrankung wird bei der Einschreibung mit einem validierten IBS-Symptomfragebogen bestimmt. Es werden routinemäßige Bluttests durchgeführt, einschließlich eines vollständigen Blutbildes, eines biochemischen Profils und eines C-reaktiven Proteins. Die rektale Druck- und Schmerzempfindlichkeit wird mit dem Barostat-Gerät beurteilt. Das Barostat-Gerät wurde in vielen anderen Studien als Maß für viszerale Überempfindlichkeit verwendet. Die Ausrüstung für beide Tests ist derzeit in unserem Labor im Einsatz. Es wird eine Ausgangskoloskopie durchgeführt und rektale Biopsien werden entnommen. Zehn Kontrollpersonen, die sich einer Screening-Koloskopie auf Polypen oder Darmkrebs unterziehen und bei denen anschließend eine normale Koloskopie festgestellt wurde, werden in die FGI-Bx-Studie aufgenommen, in der ihre Gewebeproben in dieser Studie verwendet würden.

Baseline-Proben von IBS:

1 Rektalgewebe (formalinfixiert für die Histologie) 2 Rektalgewebe (SERT-Polymorphismus) 3 Rektalgewebe (Mukosa-Mikrobiota) 5 ml Blut in EDTA-Röhrchen (SERT-Polymorphismus)

Proben von Kontrollen:

1 Rektalgewebe (formalinfixiert für die Histologie) 2 Rektalgewebe (SERT-Polymorphismus) 3 Rektalgewebe (Mukosa-Mikrobiota) 5 ml Blut in EDTA-Röhrchen (SERT-Polymorphismus)

Intervention IBS-Patienten erhalten VSL#3 (450 Milliarden lyophilisierte Bakterien/Beutel) zweimal täglich für 4 Wochen. VSL#3 wurde für die Verwendung in dieser Studie ausgewählt, weil (a) es drei verschiedene Bifidobakterien-Stämme (zusätzlich zu Laktobazillen und Streptokokken) enthält und die begrenzten verfügbaren Beweise für Bifidobakterien als die wirksamsten Probiotika bei IBS gelten (13). Ein Flussdiagramm der Studie befindet sich in Anhang 1.

Woche 4 Bewertung

Klinisches Ansprechen auf die probiotische Therapie Die Bewertungen werden zu Studienbeginn und am 28. Tag der Therapie vorgenommen. Die drei Symptome von IBS werden bewertet, um das Ansprechen auf die Therapie zu bestimmen: Bauchschmerzen/-beschwerden, Blähungen/Völlegefühl und Stuhlgang, jeweils bewertet auf einer Ordinalskala (Likert-Skala; maximale Punktzahl 7) und auf einer visuellen Analogskala von 100 mm (VAS; Höchstpunktzahl 100). Zusätzlich wird für jeden Patienten ein zusammengesetzter Score aus den Summen der 3 Leitsymptome berechnet (Likert-Skala Maximalwert 21) (VAS; Maximalwert 300). Wiederholte rektale Empfindlichkeitstests werden durchgeführt.

Veränderungen der Schleimhautmikrobiota als Reaktion auf die probiotische Therapie Die Bewertungen werden zu Studienbeginn und am 28. Tag vorgenommen. Aufgrund der etwas invasiven Natur einer wiederholten Koloskopie führen die Ermittler nur eine flexible Sigmoidoskopie durch, um nach der probiotischen Behandlung rektale Biopsien zu erhalten.

Proben aus Woche 4 von IBS:

1. Rektumgewebe (formalinfixiert für die Histologie)
2. Rektalgewebe (SERT-Polymorphismus)
3. Rektalgewebe (Mukosa-Mikrobiota)

5 ml Blut in EDTA (SERT-Polymorphismus)

Nachsorge nach sechs Monaten Die Patienten werden nach sechs Monaten kontaktiert, um die Symptomwerte neu zu bewerten und die längerfristige Wirkung der Therapie zu bestimmen.

KOLONOSKOPIE Die Koloskopie wird ambulant unter bewusster Sedierung mit intravenösem Diazepam und Pethidin durchgeführt. Die Probanden erhalten eine Darmvorbereitung mit PEG. Für die flexible Sigmoidoskopie wird eine unvorbereitete Untersuchung durchgeführt und vier Biopsien werden 15 cm vom Analrand entnommen.

RECTAL BAROSTAT Das Barostat-Gerät enthält ein eingebautes Computersystem, das so programmiert werden kann, dass es Ballondehnungen mit festen Zeitverzögerungen und Beuteldruckerhöhungen automatisch durchführt. Die Veränderung des Ballonvolumens bei konstantem Druck spiegelt die Veränderung des Tonus und der Nachgiebigkeit der Eingeweidewand wider. Darüber hinaus kann durch eine programmierte Variation des Drucks im Ballon die sensorische Schwelle des Subjekts bewertet werden.

Der Patient wird angewiesen, 4 Stunden vor der Untersuchung zu Hause 4,5 fl oz Natriumphosphat zur rektalen Reinigung rektal zu verabreichen. Nach 3-stündigem Fasten wird der Teilnehmer in Linksseitenlage positioniert. Ein Barostatbeutel wird in das Rektum eingeführt. Das Barostat-Gerät wird mit einem PVC-Schlauch mit geringer Nachgiebigkeit an den Barostat-Katheter angeschlossen.

Nach 10 Minuten Ruhe werden phasische isobare rektale Dehnungen automatisch unter Verwendung des aufsteigenden Grenzwertmethodeprotokolls (AML) mit aufeinanderfolgenden Inkrementen von 4 mm Hg (40 Sekunden Dauer) abwechselnd mit intermittierenden Perioden der Beutelentleerung (40 Sekunden) durchgeführt. Während jeder Dehnungsphase wird der Teilnehmer aufgefordert, die Wahrnehmungsbewertungen durch Drücken auf das Wahrnehmungsfeld des Barostat-Geräts mit der folgenden Skala zu melden: (1) Kein Gefühl der Ballondehnung, (2) das erste Gefühl der Ballondehnung, (3) Verlangen nach Stuhlgang, (4) maximal erträgliche Empfindung. Das Verfahren wird abgebrochen, wenn Schmerzen oder maximal tolerierbare Empfindungen gemeldet werden. Die sensorische Schwelle ist definiert als Untergrenze des Beuteldrucks, der das erste Gefühl einer Ballondehnung hervorruft. Die Schmerzschwelle ist als Druck definiert, der eine "Schmerz"-Reaktion oder ein maximal tolerierbares Gefühl hervorruft.

MUKOSALE MIKROBIOTA Es werden Darmproben entnommen, um die anhaftende Bakterienflora darzustellen. Alle Proben werden bis zur Verwendung bei -80 Grad Celsius gelagert. Jede Probe wird in Röhrchen gegeben, die 500 &mgr;l Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (24:24:1) und 500 &mgr;l Zirkonoxid/Silica-Kügelchen mit 0,1 mm Durchmesser (Biospec Products, Barthesville, OK) enthalten. Mikrobielle Zellen werden mechanisch bei 23 Grad Celsius mit einem Perlschläger (Biospec Products, Instrument für 2 Minuten auf hoch eingestellt) aufgeschlossen. Isolierte DNA wird durch Elektrophorese durch 1 % Agarosegele fraktioniert und die dominante Bande wird mit dem MiniElute Gel Extraction Kit (Qiagen) gereinigt.

Die Amplifikation der bakteriellen 16S-ribosomalen RNA-Sequenzen für die Pyrosequenzierung wird durch PCR durchgeführt. Für jede Probe werden 100-200 mg gereinigter genomischer DNA amplifiziert, indem die Primer BSR357-A und BSF8-B verwendet werden, die an konservierte Regionen des bakteriellen 16s-rRNA-Gens anlagern. Die PCR-Produkte werden unter Verwendung des 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX-Systems (bereitgestellt von der Faculty of Science, CUHK) sequenziert. Die Qualitätskontrolle wird durch die folgenden Kriterien erreicht: Die Sequenz sollte (i) eine perfekte Übereinstimmung mit dem Strichcode und dem 16S ribosomalen RNA-Genprimer aufweisen, (ii) mindestens 50 Nukleotide lang sein, (iii) nicht mehr als zwei haben unbestimmte Basen in der gelesenen Sequenz, und (iv) mindestens eine 75%ige Übereinstimmung mit einer zuvor bestimmten 16S-ribosomalen RNA-Gensequenz aufweisen. Das Clustering und die Analyse der Operational Taxonomic Unit (OTU) werden mit OTUPicker durchgeführt. Clustering und Hauptkoordinatenanalyse werden mit UniFrac durchgeführt. Da Fehler bei der Pyrosequenzierung mit einer Rate von nur 0,25 % auftreten, enthalten die meisten der 400-Nukleotid-Sequenzen, die nach dem Filtern verbleiben, entweder 0 oder 1 Fehler. Dieser Grad an Sequenzierungsfehlern wirkt sich nicht auf die taxonomische Analyse aus.

Der endgültige Datensatz für die taxonomische Analyse von Kolonmikroben wird mit der Ribosomal Database Project Release 10 mit 1.358.426 Sequenzen verglichen.

SEROTONIN-TRANSPORTER-POLYMORPHISMUS Zur Genotypisierung wird DNA aus Blutplättchen (aus venösem Blut) und Dickdarmbiopsien durch standardmäßige Phenol/Chloroform-Extraktion isoliert.

Der 44-bp-Insertions-/Deletionspolymorphismus in der Promotorregion (SERT-P) wird durch PCR der Proben-DNA mit Vorwärtsprimer 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' und Rückwärtsprimer 5'-GGC GTT analysiert GCC GCT CTG AAT GC-3'. Die erwarteten Produktgrößen sind 484 bp für die Deletion (s) bzw. 528 bp für die Insertion (l).

Der 17-bp-VNTR-Polymorphismus des SERT-Gen-Introns 2 wird durch PCR von Proben-DNA mit Vorwärtsprimer 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' und Rückwärtsprimer 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 untersucht '. Die erwarteten Produktgrößen für die Allele 9, 10, 11 und 12 sind 253 bp, 270 bp, 287 bp bzw. 304 bp.

Die Kolon- und Thrombozyten-SERT-Proteinexpression wird auch durch Echtzeit-PCR und Western-Blot-Methode untersucht.