A zsigeri túlérzékenység manipulálása probiotikus baktériumokkal irritábilis bél szindróma esetén

Háttér

Az irritábilis bél szindróma (IBS) mögött meghúzódó mechanizmusok hiányos ismerete akadályozta az erre az állapotra hatékony terápia kifejlesztését. Ez már régóta esedékes egy olyan állapot esetében, amely a lakosság legalább 20 százalékát érinti (1), és nagymértékben befolyásolja a betegek életminőségét (QOL) (2). Az IBS mögöttes etiológiájának és patogenezisének jelenlegi ismeretei a következőkre összpontosítanak: két szint: az agy-bél tengely, amely képet ad arról, hogy a stressz, az érzelmek és a pszichológiai állapotok hogyan változtatják meg az IBS-tünetek észlelését. A bélfalon belül az IBS-ben szerepet játszó patofiziológiai mechanizmusok közé tartozik a fertőzés, az immunaktiváció, a dysmotilitás, az abnormális fermentáció és a zsigeri túlérzékenység. Tanulmányok kimutatták, hogy a stresszre adott zsigeri fájdalomküszöb alacsonyabb az IBS-ben szenvedő betegeknél, mint az egészséges önkénteseknél (3). Ez a túlérzékenység mind fizikai, mind kémiai ingerre adott válaszként nyilvánvaló, de a zsigeri túlérzékenység kiváltó okai nagyrészt ismeretlenek. a bélbaktériumok jelentős szerepet játszanak az IBS kiváltásában. Például a fertőzés utáni IBS a betegek egy alcsoportjában alakult ki gasztroenteritisz után (4). A kommenzális mikrobiota manipulálása enyhítheti az IBS tüneteit, és van néhány bizonyíték arra, hogy bizonyos Bifidobaktériumokat tartalmazó probiotikus készítmények különösen hatékonyak lehetnek (5). Ez a javaslat a zsigeri túlérzékenység hátterében álló mechanizmusok további feltárására fog összpontosítani a probiotikus készítménnyel történő terápia jövőbeli célzott irányítása érdekében.

Célok A tanulmány célja (i) a bélmikrobióta IBS-hez kapcsolódó változásainak azonosítása; (ii) a SERT expressziójának és genotipizálásának tanulmányozása, valamint ezek kapcsolata a bél mikrobiotával, és (iii) annak meghatározása, hogy a probiotikus terápia megváltoztatja-e a zsigeri érzékenységet az IBS-ben szenvedő betegeknél, és hogy a zsigeri túlérzékenység probiotikumok által kiváltott változásai összefüggésben állnak-e a bélmikrobióta változásaival .

Hipotézis A kutatók azt feltételezik, hogy a baktériumok modulálják a szenzoros afferens jelátvitelt és a szerotonin jelátvitelt, amelyek szükségesek a zsigeri érzékeléshez, és ezek az útvonalak célozhatók az IBS probiotikus baktériumokkal történő terápiájában.

KUTATÁSI TERV Ez a tanulmány két részből áll. Az első rész egy keresztmetszeti vizsgálat lesz, amely a vastagbél mikrobiotáját és a SERT expresszióját hasonlítja össze IBS-ben szenvedő betegeknél és egészséges kontrolloknál. A második rész egy nyílt kísérleti vizsgálatot tartalmaz az orális probiotikus baktériumok zsigeri túlérzékenységre, SERT-expresszióra és nyálkahártya mikrobiotára gyakorolt ​​hatásának felmérésére IBS-ben szenvedő betegeknél.

Kiindulási vizit Tíz IBS-ben szenvedő alanyt vesznek fel a járóbeteg-klinikákról. A betegség súlyosságát a beiratkozáskor egy validált IBS tünetkérdőív segítségével határozzák meg. Rutin vérvizsgálatokat kell végezni, beleértve a teljes vérképet, a biokémiai profilt és a C-reaktív fehérjét. A végbél nyomásra és fájdalomra való érzékenységét Barostat készülékkel értékeljük. A Barostat készüléket sok más tanulmányban is használták a zsigeri túlérzékenység mérésére. Laboratóriumunkban jelenleg mindkét vizsgálat berendezése használatban van. Kiindulási kolonoszkópiát végeznek, és végbélbiopsziát vesznek. A polipok vagy a vastagbélrák kimutatására kolonoszkópiás szűrésen átesett, majd normális kolonoszkópiával rendelkező kontrollt bevonnak az FGI-Bx vizsgálatba, amelyben az ő szövetmintáikat használnák fel ebben a vizsgálatban.

Kiindulási minták az IBS-ből:

1 rektális szövet (szövettanilag fixált formalin) 2 rektális szövet (SERT polimorfizmus) 3 végbélszövet (nyálkahártya mikrobiota) 5 ml vér EDTA csőben (SERT polimorfizmus)

Minták a vezérlőkből:

1 rektális szövet (szövettanilag fixált formalin) 2 rektális szövet (SERT polimorfizmus) 3 végbélszövet (nyálkahártya mikrobiota) 5 ml vér EDTA csőben (SERT polimorfizmus)

Beavatkozó IBS-betegek VSL#3-at (450 milliárd liofilizált baktérium/tasak) kapnak naponta kétszer 4 héten keresztül. A VSL#3-at azért választottuk ki ebben a vizsgálatban, mert (a) három különböző Bifidobacteria törzset tartalmaz (a laktobacillusokon és streptococcusokon kívül), és a rendelkezésre álló korlátozott bizonyítékok alapján a Bifidobacteria a leghatékonyabb probiotikum az IBS-ben (13). A tanulmány folyamatábrája az 1. mellékletben található.

4. hét Értékelés

A probiotikus terápiára adott klinikai válasz A kiértékeléseket a kezelés kezdetén és a terápia 28. napján kell elvégezni. A terápiára adott válasz meghatározásához az IBS három tünetét értékelik: hasi fájdalom/diszkomfort, puffadás/feszülés és székletürítés, mindegyiket ordinális skálán (Likert-skála; maximális pontszám 7) és 100 mm-es vizuális analóg skálán (VAS; maximális pontszám 100). A 3 fő tünet összegéből összetett pontszámot is számítanak minden betegre (Likert-skála maximális pontszáma 21) (VAS; maximális pontszám 300). Ismételt rektális érzékenységi vizsgálatra kerül sor.

Változások a nyálkahártya mikrobiotájában a probiotikus terápia hatására A kiértékelést a kiinduláskor és a 28. napon végzik el. Az ismételt kolonoszkópia némileg invazív jellege miatt a vizsgálók csak rugalmas szigmoidoszkópiát végeznek, hogy probiotikus kezelést követően rektális biopsziát kapjanak.

4. heti minták az IBS-ből:

1. rektális szövet (szövettanhoz fixált formalin)
2. rektális szövetek (SERT polimorfizmus)
3. rektális szövetek (nyálkahártya mikrobiota)

5 ml vér EDTA-ban (SERT polimorfizmus)

Hat hónapos követés A betegekkel 6 hónapos korban felvesszük a kapcsolatot, hogy újraértékeljük a tünetek pontszámát a terápia hosszabb távú hatásának meghatározása érdekében.

KOLONOSZKÓPIA A vastagbéltükrözést ambuláns eljárásként, tudatos nyugtatás mellett intravénás diazepammal és petidinnel végezzük. Az alanyok bélelőkészítést kapnak PEG-gel. Rugalmas szigmoidoszkópiához előkészítetlen vizsgálatot kell végezni, és négy biopsziát kell venni az anális szélétől 15 cm-re.

RECTAL BAROSTAT A Barostat készülék beépített számítógépes rendszert tartalmaz, amely programozható úgy, hogy automatikusan végrehajtsa a ballon kitágítását fix időeltolódásokkal és a zsák nyomásának növelésével. A ballon térfogatának állandó nyomás melletti változása a zsigeri fal tónusának és megfelelőségének változását tükrözi. Ezenkívül a ballonon belüli nyomás programozott változásán keresztül az alany szenzoros küszöbe értékelhető.

A pácienst arra utasítják, hogy adjon be 4,5 fl oz nátrium-foszfátot rektálisan 4 órával az otthoni vizsgálat előtt a végbéltisztítás céljából. 3 órás böjt után a résztvevő bal oldalsó helyzetbe kerül. Barostat zsákot helyezünk a végbélbe. A barosztát eszközt a barosztát katéterhez csatlakoztatják egy alacsony konformitású PVC cső segítségével.

10 perces pihentetés után a fázisos izobár végbéltágítások automatikusan végrehajtásra kerülnek a határértékek emelkedő módszerével (AML) 4 Hgmm-es (40 másodperces időtartam) egymást követő lépésekben, váltakozva a tasak időszakos leeresztésével (40 másodperc). Minden egyes tágulási fázisban a résztvevőnek jelentenie kell az érzékelési értékelést a barosztát készülék érzékelési paneljének megnyomásával a következő skálán: (1) Nincs léggömb tágulási érzése, (2) a ballon kitágulás első érzése, (3) székletürítési vágy, (4) maximálisan elviselhető érzés. Az eljárást leállítják, ha fájdalmat vagy maximálisan elviselhető érzést észlelnek. Az érzékszervi küszöb a zsák nyomásának alsó határa, amely a ballon kinyújtásának első érzetét váltja ki. A fájdalomküszöböt olyan nyomásként határozzák meg, amely "fájdalom" választ vagy maximálisan elviselhető érzést vált ki.

Nyálkahártya MIKROBIÓTA A vastagbélből mintákat veszünk a tapadó baktériumflóra reprezentálására. Minden mintát -80 Celsius fokon tárolunk felhasználásig. Minden mintát 500 µl fenolt tartalmazó csövekhez kell adni: kloroform: izoamil-alkohol (24:24:1) és 500 µl 0,1 mm átmérőjű cirkónium-dioxid/szilícium-dioxid gyöngy (Biospec Products, Barthesville, OK). A mikrobiális sejteket mechanikusan roncsoljuk 23 Celsius fokon gyöngyverővel (Biospec Products, a műszer 2 percre magasra állítva). Az izolált DNS-t elektroforézissel frakcionáljuk 1%-os agarózgélen keresztül, és a domináns sávot MiniElute Gel Extraction kit (Qiagen) segítségével tisztítjuk.

A bakteriális 16S riboszomális RNS-szekvenciák piroszekvenáláshoz való amplifikációját PCR-rel végezzük. Minden mintánál 100-200 mg tisztított genomiális DNS-t amplifikálunk a BSR357-A és BSF8-B primerek használatával, amelyek a bakteriális 16s rRNS gén konzervált régióihoz kapcsolódnak. A PCR-termékeket a 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX rendszer segítségével szekvenálják (a CUHK Természettudományi Kara). A minőségellenőrzést a következő kritériumok szerint kell elérni: a szekvenciának (i) tökéletesen illeszkednie kell a vonalkódhoz és a 16S riboszomális RNS-gén primerhez, (ii) legalább 50 nukleotid hosszúságúnak kell lennie, (iii) legfeljebb kettőnek kell lennie. meghatározatlan bázisok a beolvasott szekvenciában, és (iv) legalább 75%-ban egyeznek egy korábban meghatározott 16S riboszomális RNS génszekvenciával. Az operatív taxonómiai egységek (OTU) klaszterezése és elemzése az OTUPicker segítségével történik. A klaszterezés és a főkoordináta-elemzés UniFrac segítségével történik. Mivel a piroszekvenálás során a hibák csak 0,25%-os arányban fordulnak elő, a szűrés után megmaradó 400 nukleotidból álló szekvencia többsége 0 vagy 1 hibát tartalmaz. A szekvenálási hiba ilyen szintje nem befolyásolja a taxonómiai elemzést.

A vastagbél-mikrobiális taxonómiai elemzés végső adatkészletét összehasonlítják az 1 358 426 szekvenciából álló Ribosomal Database Project 10. kiadásával.

SZEROTONIN SZÁLLÍTÓ POLIMORFIZMUS A genotipizáláshoz a DNS-t a vérlemezkékből (vénás vérből) és a vastagbélbiopsziákból izoláljuk standard fenol/kloroform extrakcióval.

A 44 bp-os inszerciós/deléciós polimorfizmust a promoter régióban (SERT-P) a minta DNS PCR-jével elemezzük 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' és reverz 5'-GGC GTT primerrel. GCC GCT CTG AAT GC-3'. A termék várható mérete 484 bp a deléció(k) és 528 bp az inszerció (l) esetében.

A SERT gén 2. intronjának 17 bp-os VNTR polimorfizmusát a minta DNS PCR-jével vizsgáljuk 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' és reverz primer 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 segítségével. '. A 9., 10., 11. és 12. allélok várható termékméretei 253 bp, 270 bp, 287 bp és 304 bp.

A vastagbél és a vérlemezke SERT fehérje expresszióját valós idejű PCR és Western blot módszerrel is tanulmányozzuk.