Манипуляция висцеральной гиперчувствительностью с помощью пробиотических бактерий при синдроме раздраженного кишечника

Фон

Неполное понимание механизмов, лежащих в основе синдрома раздраженного кишечника (СРК), препятствует разработке эффективной терапии этого состояния. Это давно назрело для состояния, которое затрагивает не менее 20 процентов населения (1) и оказывает большое влияние на качество жизни (КЖ) пациента (2). Современное понимание лежащей в основе этиологии и патогенеза СРК сосредоточено на два уровня: ось мозг-кишка, которая дает представление о том, как стресс, эмоции и психологические состояния изменяют восприятие симптомов СРК. Внутри кишечной стенки патофизиологические механизмы, которые вовлечены в СРК, включают инфекцию, иммунную активацию, нарушение моторики, аномальное брожение и висцеральную гиперчувствительность. Исследования показали, что пороги висцеральной боли в ответ на стресс ниже у пациентов с СРК по сравнению со здоровыми добровольцами (3). Эта гиперчувствительность проявляется в ответ как на физические, так и на химические раздражители, но триггеры висцеральной гиперчувствительности остаются в значительной степени неизвестными. кишечные бактерии играют значительную роль в индуцировании СРК. Например, постинфекционный СРК развился в подгруппе пациентов после приступа гастроэнтерита (4). Манипуляции с комменсальной микробиотой могут облегчить симптомы СРК, и есть некоторые свидетельства того, что пробиотические препараты, содержащие определенные бифидобактерии, могут быть особенно эффективными (5). Это предложение будет сосредоточено на дальнейшем изучении механизмов, лежащих в основе висцеральной гиперчувствительности, чтобы направить будущую таргетную терапию пробиотическими препаратами.

Цели Целями данного исследования являются (i) выявление связанных с СРК изменений кишечной микробиоты; (ii) изучить экспрессию и генотипирование SERT, а также их взаимосвязь с микробиотой кишечника, и (iii) определить, изменяет ли терапия пробиотиками висцеральную чувствительность у пациентов с СРК и связаны ли вызванные пробиотиками изменения висцеральной гиперчувствительности с изменениями микробиоты кишечника .

Гипотеза. Исследователи постулируют, что бактерии модулируют сенсорную афферентную передачу сигналов и передачу сигналов серотонина, необходимых для висцеральной чувствительности, и что эти пути могут быть нацелены на лечение СРК с использованием пробиотических бактерий.

ПЛАН ИССЛЕДОВАНИЯ Настоящее исследование состоит из двух частей. Первая часть будет представлять собой перекрестное исследование, сравнивающее микробиоту толстой кишки и экспрессию SERT у пациентов с СРК и здоровых людей. Вторая часть будет включать пилотное открытое исследование для оценки влияния пероральных пробиотических бактерий на висцеральную гиперчувствительность, экспрессию SERT и микробиоту слизистых оболочек у пациентов с СРК.

Исходный визит Десять пациентов с СРК будут набраны из амбулаторных клиник. Тяжесть заболевания будет определяться при регистрации с помощью утвержденного опросника по симптомам СРК. Будут проводиться рутинные анализы крови, включая общий анализ крови, биохимический профиль и определение С-реактивного белка. Ректальную чувствительность к давлению и боли оценивают с помощью устройства Barostat. Устройство Barostat использовалось во многих других исследованиях для измерения висцеральной гиперчувствительности. Оборудование для обоих тестов в настоящее время используется в нашей лаборатории. Будет выполнена базовая колоноскопия и взята ректальная биопсия. Десять человек из контрольной группы, прошедших скрининговую колоноскопию на наличие полипов или колоректального рака и впоследствии у которых была обнаружена нормальная колоноскопия, будут включены в исследование FGI-Bx, в котором образцы их тканей будут использоваться в этом исследовании.

Исходные образцы от IBS:

1 ткань прямой кишки (фиксированная формалином для гистологии) 2 ткани прямой кишки (полиморфизм SERT) 3 ткани прямой кишки (микробиота слизистой оболочки) 5 мл крови в пробирке с ЭДТА (полиморфизм SERT)

Образцы из контролей:

1 ткань прямой кишки (фиксированная формалином для гистологии) 2 ткани прямой кишки (полиморфизм SERT) 3 ткани прямой кишки (микробиота слизистой оболочки) 5 мл крови в пробирке с ЭДТА (полиморфизм SERT)

Вмешательство Пациенты с СРК будут получать VSL#3 (450 миллиардов лиофилизированных бактерий/саше) два раза в день в течение 4 недель. VSL#3 был выбран для использования в этом исследовании, потому что (а) он содержит три различных штамма бифидобактерий (в дополнение к лактобактериям и стрептококкам) и ограниченные данные о том, что бифидобактерии являются наиболее эффективными пробиотиками при СРК (13). Блок-схема исследования находится в приложении 1.

Неделя 4 Оценка

Клинический ответ на пробиотическую терапию Оценки будут проводиться в начале исследования и на 28-й день терапии. Для определения ответа на терапию будут оцениваться три симптома СРК: боль/дискомфорт в животе, вздутие живота/растяжение и дефекация, каждый из которых оценивается по порядковой шкале (шкала Лайкерта; максимальная оценка 7) и по 100-мм визуальной аналоговой шкале (ВАШ; максимальный балл 100). Для каждого пациента также рассчитывается составная оценка с суммой 3 основных симптомов (максимальный балл по шкале Лайкерта 21) (ВАШ; максимальный балл 300). Будет проведено повторное тестирование ректальной чувствительности.

Изменения микробиоты слизистой оболочки в ответ на пробиотическую терапию Оценки будут проводиться в начале исследования и на 28-й день. Из-за несколько инвазивного характера повторной колоноскопии исследователи будут выполнять только гибкую сигмоидоскопию для получения биопсии прямой кишки после лечения пробиотиками.

Образцы 4-й недели от IBS:

1. ректальная ткань (фиксированная формалином для гистологии)
2. ткани прямой кишки (полиморфизм SERT)
3. ректальные ткани (слизистая микробиота)

5 мл крови в ЭДТА (полиморфизм SERT)

Шесть месяцев наблюдения С пациентами свяжутся через 6 месяцев для повторной оценки симптомов и определения долгосрочного воздействия терапии.

КОЛОНОСКОПИЯ Колоноскопия будет проводиться амбулаторно под седативным действием внутривенного диазепама и петидина. Субъекты получат подготовку кишечника с помощью ПЭГ. Для гибкой сигмоидоскопии проводится неподготовленное обследование и берутся четыре биопсии на расстоянии 15 см от анального края.

РЕКТАЛЬНЫЙ БАРОСТАТ Устройство баростата содержит встроенную компьютерную систему, которую можно запрограммировать для автоматического выполнения растяжения баллона с фиксированными временными задержками и приращениями давления в мешке. Изменение объема баллона при постоянном давлении отражает изменение тонуса и податливости висцеральной стенки. Кроме того, посредством запрограммированного изменения внутрибаллонного давления можно оценить сенсорный порог субъекта.

Пациента проинструктировали ввести 4,5 жидких унции фосфатов натрия ректально за 4 часа до исследования в домашних условиях для очищения прямой кишки. После 3-часового голодания участник будет помещен в левое боковое положение. В прямую кишку вводят баростатический мешок. Устройство баростата соединяется с катетером баростата с помощью трубки из ПВХ с низкой податливостью.

После 10 минут отдыха автоматически выполняются фазные изобарические растяжения прямой кишки по протоколу метода восходящих пределов (AML) с последовательными приращениями на 4 мм рт. Во время каждой фазы растяжения участника просят сообщать об оценках восприятия, нажимая на панель восприятия баростата со следующей шкалой: (1) отсутствие ощущения растяжения баллона, (2) первое ощущение растяжения баллона, (3) желание дефекации, (4) максимально переносимое ощущение. Процедура будет остановлена, когда появится сообщение о боли или максимально переносимых ощущениях. Сенсорный порог определяется как нижний предел давления в мешке, который вызывает первое ощущение растяжения баллона. Болевой порог определяется как давление, вызывающее «болевую» реакцию или максимально переносимое ощущение.

МИКРОБИОТА СЛИЗИСТЫХ Образцы толстой кишки будут взяты для представления прикрепленной бактериальной флоры. Все образцы будут храниться при температуре -80 градусов Цельсия до использования. Каждый образец будет добавлен в пробирки, содержащие 500 мкл фенола: хлороформа: изоамилового спирта (24:24:1) и 500 мкл гранул циркония/диоксида кремния диаметром 0,1 мм (Biospec Products, Barthesville, OK). Микробные клетки будут механически разрушены при 23 градусах Цельсия с помощью бисерной мешалки (Biospec Products, прибор установлен на высокую мощность на 2 минуты). Выделенную ДНК фракционируют с помощью электрофореза в 1% агарозных гелях, а доминирующую полосу очищают с помощью набора MiniElute Gel Extraction (Qiagen).

Амплификацию последовательностей бактериальной рибосомной РНК 16S для пиросеквенирования проводят с помощью ПЦР. Для каждого образца 100-200 мг очищенной геномной ДНК будут амплифицировать с использованием праймеров BSR357-A и BSF8-B, которые отжигаются с консервативными областями бактериального гена 16s рРНК. Продукты ПЦР будут секвенированы с использованием системы FLX 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer (предоставленной Факультетом естественных наук CUHK). Контроль качества будет осуществляться по следующим критериям: последовательность должна (i) полностью совпадать со штрих-кодом и праймером гена 16S рибосомной РНК, (ii) иметь длину не менее 50 нуклеотидов, (iii) иметь не более двух неопределенные основания в прочитанной последовательности и (iv) имеют по меньшей мере 75% совпадение с ранее определенной последовательностью гена 16S рибосомной РНК. Кластеризация и анализ операционных таксономических единиц (OTU) будут проводиться с использованием OTUPicker. Кластеризация и анализ в главных координатах будут проводиться с использованием UniFrac. Поскольку ошибки при пиросеквенировании встречаются с частотой всего 0,25%, большинство из 400-нуклеотидных последовательностей, оставшихся после фильтрации, будут содержать либо 0, либо 1 ошибку. Этот уровень ошибки секвенирования не повлияет на таксономический анализ.

Окончательный набор данных для таксономического анализа микробов толстой кишки будет сравниваться с выпуском 10 проекта базы данных рибосом, состоящим из 1 358 426 последовательностей.

ПОЛИМОРФИЗМ ПЕРЕНОСЧИКОВ СЕРОТОНИНА Для генотипирования ДНК выделяют из тромбоцитов (из венозной крови) и биоптатов толстой кишки с помощью стандартной экстракции фенолом/хлороформом.

Полиморфизм вставки/делеции длиной 44 п.н. в промоторной области (SERT-P) будет проанализирован с помощью ПЦР образца ДНК с прямым праймером 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' и обратным праймером 5'-GGC GTT. ГХК ГКТ КТГ ААТ ГК-3'. Ожидаемые размеры продукта составляют 484 п.н. для делеции (s) и 528 п.н. для вставки (l) соответственно.

Полиморфизм 17-пн VNTR интрона 2 гена SERT будет изучен методом ПЦР образца ДНК с прямым праймером 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' и обратным праймером 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. Ожидаемые размеры продуктов для аллелей 9, 10, 11 и 12 составляют 253 п.н., 270 п.н., 287 п.н. и 304 п.н. соответственно.

Экспрессию белка SERT в толстой кишке и тромбоцитах также будут изучать с помощью ПЦР в реальном времени и метода вестерн-блоттинга.