Manipulace viscerální hypersenzitivity s probiotickými bakteriemi u syndromu dráždivého tračníku

Pozadí

Neúplné pochopení mechanismů, které jsou základem syndromu dráždivého tračníku (IBS), brzdilo vývoj účinné terapie pro tento stav. U stavu, který postihuje nejméně 20 procent populace (1) a má velký dopad na kvalitu života pacienta (QOL) (2), je to již dávno. Současné chápání základní etiologie a patogeneze IBS se soustředí na dvě úrovně: osa mozek-střevo, která poskytuje představu o tom, jak stres, emoce a psychické podmínky mění vnímání symptomů IBS. Ve střevní stěně patofyziologické mechanismy, které se podílejí na IBS, zahrnují infekci, imunitní aktivaci, dysmotilitu, abnormální fermentaci a viscerální hypersenzitivitu. Studie ukázaly, že prahové hodnoty viscerální bolesti v reakci na stres jsou u pacientů s IBS ve srovnání se zdravými dobrovolníky nižší (3). Tato přecitlivělost je zřejmá v reakci na fyzikální i chemický podnět, ale spouštěče viscerální přecitlivělosti zůstávají do značné míry neznámé. střevní bakterie hrají významnou roli při indukci IBS. Například postinfekční IBS se vyvinul u podskupiny pacientů po záchvatu gastroenteritidy (4). Manipulace s komenzální mikroflórou může zmírnit příznaky IBS a existují určité důkazy, že probiotické přípravky obsahující určité bifidobakterie mohou být zvláště účinné (5). Tento návrh se zaměří na další zkoumání mechanismů, které jsou základem viscerální přecitlivělosti, s cílem přímého budoucího cílení terapie probiotickými přípravky.

Cíle Cílem této studie je (i) identifikovat změny ve střevní mikrobiotě spojené s IBS; (ii) ke studiu exprese a genotypizace SERT a jejich vztahu ke střevní mikrobiotě a (iii) ke stanovení, zda probiotická terapie mění viscerální citlivost u pacientů s IBS a zda změny viscerální hypersenzitivity vyvolané probiotiky jsou spojeny se změnami ve střevní mikrobiotě .

Hypotéza Výzkumníci předpokládají, že bakterie modulují senzorickou aferentní signalizaci a serotoninovou signalizaci, nezbytné pro viscerální čití, a že tyto dráhy mohou být cíleny pro terapii IBS pomocí probiotických bakterií.

VÝZKUMNÝ PLÁN Tato studie se skládá ze dvou částí. První částí bude průřezová studie srovnávající mikrobiotu tlustého střeva a expresi SERT u pacientů s IBS a zdravých kontrol. Druhá část bude zahrnovat pilotní otevřenou studii k posouzení účinků orálních probiotických bakterií na viscerální hypersenzitivitu, expresi SERT a slizniční mikrobiotu u pacientů s IBS.

Základní návštěva Deset subjektů s IBS bude rekrutováno z ambulantních klinik. Závažnost onemocnění bude stanovena při zápisu pomocí validovaného dotazníku symptomů IBS. Budou získány rutinní krevní testy včetně úplného krevního obrazu, biochemického profilu a C-reaktivního proteinu. Rektální citlivost na tlak a bolest bude hodnocena přístrojem Barostat. Zařízení Barostat bylo použito v mnoha dalších studiích jako měřítko viscerální hypersenzitivity. Zařízení pro oba testy je v současné době v naší laboratoři používáno. Bude provedena základní kolonoskopie a budou odebrány rektální biopsie. Deset kontrol, které podstoupí screeningovou kolonoskopii na polypy nebo kolorektální karcinom a následně se zjistí, že mají normální kolonoskopii, bude zahrnuto do studie FGI-Bx, ve které by byly v této studii použity vzorky jejich tkání.

Základní vzorky od IBS:

1 rektální tkáň (formalín fixovaný pro histologii) 2 rektální tkáně (polymorfismus SERT) 3 tkáně konečníku (slizniční mikroflóra) 5 ml krve ve zkumavce EDTA (polymorfismus SERT)

Ukázky z kontrol:

1 rektální tkáň (formalín fixovaný pro histologii) 2 rektální tkáně (polymorfismus SERT) 3 tkáně konečníku (slizniční mikroflóra) 5 ml krve ve zkumavce EDTA (polymorfismus SERT)

Intervence Pacienti s IBS budou dostávat VSL#3 (450 miliard lyofilizovaných bakterií/sáček) dvakrát denně po dobu 4 týdnů. VSL#3 byl vybrán pro použití v této studii, protože (a) obsahuje tři různé kmeny bifidobakterií (kromě laktobacilů a streptokoků) a omezené dostupné důkazy jsou bifidobakterie jako nejúčinnější probiotika u IBS (13) . Vývojový diagram studie je v příloze 1.

4. týden Hodnocení

Klinická odpověď na probiotickou terapii Vyhodnocení bude provedeno na začátku a 28. den terapie. Pro stanovení odpovědi na terapii budou hodnoceny tři symptomy IBS: bolest břicha/nepohodlí, nadýmání/roztažení a pohyby střev, každý hodnocený na ordinální stupnici (Likertova škála; maximální skóre 7) a na 100mm vizuální analogové škále (VAS; maximální skóre 100). Pro každého pacienta bude také vypočteno složené skóre se součty 3 hlavních symptomů (maximální skóre podle Likertovy škály 21) (VAS; maximální skóre 300). Bude provedeno opakované testování rektální citlivosti.

Změny mikroflóry sliznice v reakci na probiotickou terapii Vyhodnocení bude provedeno na začátku a v den 28. Vzhledem k poněkud invazivní povaze opakované kolonoskopie budou výzkumníci provádět pouze flexibilní sigmoidoskopii k získání rektálních biopsií po probiotické léčbě.

Vzorky 4. týdne od IBS:

1. rektální tkáň (zafixovaný formalínem pro histologii)
2. rektální tkáně (polymorfismus SERT)
3. rektální tkáně (slizniční mikrobiota)

5 ml krve v EDTA (polymorfismus SERT)

Šestiměsíční sledování Pacienti budou kontaktováni po 6 měsících, aby přehodnotili skóre symptomů a určili dlouhodobý dopad terapie.

KOLONOSKOPIE Kolonoskopie bude prováděna ambulantně za sedace při vědomí intravenózním diazepamem a pethidinem. Subjekty dostanou přípravu střev s PEG. U flexibilní sigmoidoskopie se provede nepřipravené vyšetření a budou získány čtyři biopsie ve vzdálenosti 15 cm od análního okraje.

REKTÁLNÍ BAROSTAT Zařízení barostat obsahuje vestavěný počítačový systém, který lze naprogramovat tak, aby automaticky prováděl roztahování balónku s pevnými časovými prodlevami a přírůstky tlaku vaku. Změna objemu balónku při konstantním tlaku odráží změnu tonusu a poddajnosti viscerální stěny. Kromě toho lze prostřednictvím naprogramované změny intrabalonkového tlaku vyhodnotit senzorický práh subjektu.

Pacient je instruován, aby si 4 hodiny před studiem doma podal 4,5 fl oz fosforečnanů sodných rektálně za účelem pročištění konečníku. Po 3hodinovém půstu bude účastník umístěn do levé boční polohy. Barostatový vak se zavádí do konečníku. Zařízení barostatu je připojeno ke katétru barostatu pomocí hadičky z PVC s nízkou poddajností.

Po 10 minutách klidu se automaticky provedou fázické izobarické rektální distenze pomocí protokolu vzestupné metody limitů (AML) s postupnými přírůstky o 4 mm Hg (trvání 40 sekund) střídajícími se s přerušovanými periodami vyfukování vaku (40 sekund). Během každé fáze roztažení je účastník požádán, aby nahlásil hodnocení vnímání stisknutím na panelu vnímání barostatu s následující stupnicí: (1) Žádný pocit roztažení balónku, (2) první pocit roztažení balónku, (3) touha po defekaci, (4) maximální snesitelný pocit. Procedura bude zastavena, když je hlášena bolest nebo maximální snesitelný pocit. Senzorický práh je definován jako spodní hranice tlaku vaku, která vyvolává první pocit roztažení balónku. Práh bolesti je definován jako tlak, který vyvolává „bolestivou“ reakci nebo maximální tolerovatelný pocit.

MUKOZÁLNÍ MIKROBIOTA Budou odebrány vzorky tlustého střeva reprezentující adherentní bakteriální flóru. Všechny vzorky budou až do použití skladovány při -80 stupních Celsia. Každý vzorek bude přidán do zkumavek obsahujících 500 ul fenol: Chloroform: isoamylalkohol (24:24:1) a 500 ul kuliček zirkonia/silika o průměru 0,1 mm (Biospec Products, Barthesville, OK). Mikrobiální buňky budou mechanicky rozrušeny při 23 stupních Celsia pomocí šlehače kuliček (Biospec Products, přístroj nastavený na vysokou hodnotu po dobu 2 minut). Izolovaná DNA bude frakcionována elektroforézou na 1% agarózových gelech a dominantní pás bude purifikován soupravou MiniElute Gel Extraction kit (Qiagen).

Amplifikace sekvencí bakteriální 16S ribozomální RNA pro pyrosekvenování bude provedena pomocí PCR. Pro každý vzorek bude amplifikováno 100-200 mg purifikované genomové DNA pomocí primerů BSR357-A a BSF8-B, které nasedají na konzervované oblasti bakteriálního genu 16s rRNA. Produkty PCR budou sekvenovány pomocí systému 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX (poskytovaného Přírodovědeckou fakultou CUHK). Kontrola kvality bude dosažena podle následujících kritérií: sekvence by měla (i) vykazovat dokonalou shodu s čárovým kódem a primerem genu 16S ribozomální RNA, (ii) být alespoň 50 nukleotidů dlouhá, (iii) mít ne více než dva neurčené báze ve čtené sekvenci a (iv) mají alespoň 75% shodu s dříve určenou sekvencí genu 16S ribozomální RNA. Shlukování a analýza provozní taxonomické jednotky (OTU) bude provedena pomocí OTUPicker. Shlukování a hlavní souřadnicová analýza bude provedena pomocí UniFrac. Protože chyby v pyrosekvenování se vyskytují v míře pouze 0,25 %, bude většina 400-nukleotidových sekvencí, které zůstanou po filtrování, obsahovat buď 0, nebo 1 chybu. Tato úroveň chyby řazení neovlivní taxonomickou analýzu.

Konečný soubor dat pro mikrobiální taxonomickou analýzu tlustého střeva bude porovnán s 1 358 426 sekvencemi projektu Ribosomal Database Project Release 10.

SEROTONINOVÝ TRANSPORTER POLYMORFISMUS Pro genotypizaci bude DNA izolována z krevních destiček (z žilní krve) a biopsií tlustého střeva standardní extrakcí fenol/chloroformem.

Polymorfismus inzerce/delece 44 bp v oblasti promotoru (SERT-P) bude analyzován pomocí PCR vzorku DNA s přímým primerem 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' a reverzním primerem 5'-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3'. Očekávané velikosti produktu jsou 484 bp pro deleci (s) a 528 bp pro inzerci (1).

17-bp VNTR polymorfismus intronu 2 genu SERT bude studován pomocí PCR vzorku DNA s přímým primerem 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' a reverzním primerem 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. Očekávané velikosti produktu pro alely 9, 10, 11 a 12 jsou 253 bp, 270 bp, 287 bp a 304 bp, v daném pořadí.

Exprese proteinu SERT v tlustém střevě a destičkách budou také studovány pomocí PCR v reálném čase a metodou western blot.