Manipulering av visceral overfølsomhet med probiotiske bakterier i irritabel tarmsyndrom

Bakgrunn

En ufullstendig forståelse av mekanismene bak irritabel tarmsyndrom (IBS) har hindret utviklingen av en effektiv terapi for denne tilstanden. Dette er lenge på tide for en tilstand som rammer minst 20 prosent av befolkningen (1), og som har stor innvirkning på pasientens livskvalitet (2). Nåværende forståelse av den underliggende etiologien og patogenesen til IBS er sentrert om to nivåer: hjerne-tarm-aksen som gir et konsept om hvordan stress, følelser og psykologiske forhold endrer oppfatningen av IBS-symptomer. Innenfor tarmveggen inkluderer de patofysiologiske mekanismene som er implisert i IBS infeksjon, immunaktivering, dysmotilitet, unormal fermentering og visceral overfølsomhet. Studier har vist at viscerale smerteterskler som respons på stress er lavere hos pasienter med IBS sammenlignet med friske frivillige (3). Denne overfølsomheten er tydelig som respons på både en fysisk og kjemisk stimulus, men triggerne til visceral overfølsomhet forblir stort sett ukjente. tarmbakterier spiller en betydelig rolle i å indusere IBS. For eksempel post-infeksiøs IBS utviklet i en undergruppe av pasienter etter et anfall av gastroenteritt (4). Manipulering av commensal mikrobiota kan lindre IBS-symptomer og det er noen bevis for at probiotiske preparater som inneholder visse bifidobakterier kan være spesielt effektive (5). Dette forslaget vil fokusere på ytterligere utforskning av mekanismene som ligger til grunn for visceral overfølsomhet for direkte fremtidig målretting av terapi med probiotisk preparat.

Mål Målet med denne studien er (i) å identifisere IBS-assosierte endringer i tarmmikrobiota; (ii) for å studere SERT-uttrykk og genotyping, og deres forhold til tarmmikrobiotaen, og (iii) for å bestemme om probiotisk terapi endrer visceral sensitivitet hos IBS-pasienter og om probiotika-induserte endringer i visceral hypersensitivitet er assosiert med endringer i tarmmikrobiotaen .

Hypotese Etterforskerne postulerer at bakterier modulerer sensorisk afferent signalering og serotoninsignalering, nødvendig for visceral sensasjon, og at disse banene kan målrettes for behandling av IBS ved bruk av probiotiske bakterier.

FORSKNINGSPLAN Denne studien består av to deler. Den første delen vil være en tverrsnittsstudie som sammenligner kolonmikrobiota og SERT-uttrykk hos IBS-pasienter og friske kontroller. Den andre delen vil innebære en åpen pilotstudie for å vurdere effekten av orale probiotiske bakterier i visceral hypersensitivitet, SERT-ekspresjon og slimhinnemikrobiota hos pasienter med IBS.

Utgangsbesøk Ti forsøkspersoner med IBS vil bli rekruttert fra poliklinikker. Sykdommens alvorlighetsgrad vil bli bestemt ved påmelding med et validert IBS symptom spørreskjema. Rutinemessige blodprøver inkludert full blodtelling, biokjemiprofil og C-reaktivt protein vil bli innhentet. Rektal følsomhet for trykk og smerte vil bli vurdert med Barostat-apparat. Barostat-apparatet har blitt brukt i mange andre studier som et mål på visceral overfølsomhet. Utstyr for begge testene er for tiden i bruk ved vårt laboratorium. En baseline koloskopi vil bli utført og rektale biopsier vil bli tatt. Ti kontroller som gjennomgår screening av koloskopi for polypper eller tykktarmskreft og som senere har funnet en normal koloskopi, vil bli inkludert for å delta i FGI-Bx-studien, der vevsprøvene deres vil bli brukt i denne studien.

Utgangsprøver fra IBS:

1 rektalvev (formalin fiksert for histologi) 2 rektalvev (SERT polymorfisme) 3 rektalvev (slimhinnemikrobiota) 5 ml blod i EDTA-rør (SERT polymorfisme)

Eksempler fra kontroller:

1 rektalvev (formalin fiksert for histologi) 2 rektalvev (SERT polymorfisme) 3 rektalvev (slimhinnemikrobiota) 5 ml blod i EDTA-rør (SERT polymorfisme)

Intervensjon IBS-pasienter vil motta VSL#3 (450 milliarder lyofiliserte bakterier/pose) to ganger daglig i 4 uker. VSL#3 ble valgt for bruk i denne studien fordi (a) den inneholder tre forskjellige Bifidobacteria-stammer (i tillegg til laktobaciller og streptokokker) og den begrensede evidensen tilgjengelig Bifidobacteria som de mest effektive probiotika ved IBS (13). Et flytskjema for studien er i vedlegg 1.

Uke 4 Vurdering

Klinisk respons på probiotisk terapi Vurderinger vil bli gjort ved baseline og på dag 28 av behandlingen. De tre symptomene på IBS vil bli vurdert for å bestemme respons på terapi: magesmerter/ubehag, oppblåsthet/distens og tarmbevegelser, hver skåres på en ordinær skala (Likert-skala; maksimal score 7) og på en 100 mm visuell analog skala (VAS; maksimal poengsum 100). En sammensatt skåre med summen av de 3 kardinalsymptomene vil også bli beregnet for hver pasient (Likert-skalaen maksimal score 21) (VAS; maksimal score 300). Gjentatt rektal sensitivitetstesting vil bli utført.

Endringer i slimhinnemikrobiota som respons på probiotisk terapi Vurderinger vil bli gjort ved baseline og på dag 28. På grunn av den noe invasive karakteren til en gjentatt koloskopi, vil etterforskerne kun utføre en fleksibel sigmoidoskopi for å få rektale biopsier etter probiotisk behandling.

Uke 4 prøver fra IBS:

1. rektalvev (formalin fiksert for histologi)
2. rektalvev (SERT polymorfisme)
3. rektalvev (slimhinnemikrobiota)

5 ml blod i EDTA (SERT polymorfisme)

Seks måneders oppfølging Pasienter vil bli kontaktet etter 6 måneder for å revurdere symptomskåre for å bestemme langtidseffekten av behandlingen.

KOLONOSKOPI Koloskopi vil bli utført som et poliklinisk inngrep under bevisst sedasjon med intravenøs diazepam og petidin. Forsøkspersonene vil motta tarmforberedelse med PEG. For fleksibel sigmoidoskopi utføres en uforberedt undersøkelse og det tas fire biopsier 15 cm fra analkanten.

RECTAL BAROSTAT Barostatenheten inneholder et innebygd datasystem som kan programmeres til automatisk å utføre ballongutvidelser med faste tidsforsinkelser og posetrykkøkninger. Variasjon i ballongvolum i et konstant trykk reflekterer endringen i tone og ettergivenhet til den viscerale veggen. Videre, gjennom en programmert variasjon i intraballongtrykket, kan den sensoriske terskelen til individet evalueres.

Pasienten instrueres om å administrere 4,5 fl oz natriumfosfater rektalt 4 timer før studie hjemme for rektal rensing. Etter en 3-timers faste vil deltakeren bli plassert i venstre sidestilling. En barostatpose settes inn i endetarmen. Barostatenheten er koblet til barostatkateteret ved hjelp av en PVC-slange med lav etterlevelse.

Etter 10 minutters hvile utføres fasiske isobariske rektale distensjoner automatisk ved bruk av ascending method of limits (AML)-protokollen med påfølgende økninger på 4 mm Hg (40 sekunders varighet) alternerende med periodiske perioder med tømming av posen (40 sekunder). Under hver distensjonsfase blir deltakeren bedt om å rapportere persepsjonsvurderingene ved å trykke på persepsjonspanelet til barostatenheten med følgende skala: (1) Ingen følelse av ballongdistensjon, (2) den første følelsen av ballongdistensjon, (3) ønske om avføring, (4) maksimal tolerabel følelse. Prosedyren vil bli stoppet når smerte eller maksimal tolerabel følelse er rapportert. Den sensoriske terskelen er definert som nedre grense for posetrykket som fremkaller den første følelsen av ballongutvidelse. Smerteterskelen er definert som trykk som fremkaller en "smerte"-respons eller maksimal tolerabel følelse.

MUCOSAL MICROBIOTA Kolonprøver vil bli tatt for å representere adherent bakterieflora. Alle prøver vil bli lagret ved -80 grader Celsius frem til bruk. Hver prøve vil bli tilsatt rør som inneholder 500 µl fenol: Kloroform: isoamylalkohol (24:24:1) og 500 µl 0,1 mm diameter zirkoniumoksid/silikakuler (Biospec Products, Barthesville, OK). Mikrobielle celler vil bli forstyrret mekanisk ved 23 grader Celsius med en perlevisper (Biospec Products, instrument satt på høy i 2 minutter). Isolert DNA vil bli fraksjonert ved elektroforese gjennom 1 % agarosegeler, og det dominerende båndet vil bli renset med MiniElute Gel Extraction Kit (Qiagen).

Amplifisering av de bakterielle 16S ribosomale RNA-sekvensene for pyrosekvensering vil bli utført ved PCR. For hver prøve vil 100-200 mg renset genomisk DNA bli amplifisert ved å bruke primere BSR357-A og BSF8-B, som annealer til konserverte områder av bakteriell 16s rRNA-gen. PCR-produktene vil bli sekvensert ved hjelp av 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX-systemet (levert av Det naturvitenskapelige fakultet, CUHK). Kvalitetskontroll vil bli oppnådd ved følgende kriterier: sekvensen skal (i) vise en perfekt overensstemmelse med strekkoden og 16S ribosomal RNA-genprimer, (ii) være minst 50 nukleotider lang, (iii) ikke ha mer enn to ubestemte baser i sekvensen som er lest, og (iv) har minst 75 % samsvar med en tidligere bestemt 16S ribosomal RNA-gensekvens. Operasjonell taksonomisk enhet (OTU) klynging og analyse vil bli utført ved hjelp av OTUPicker. Clustering og hovedkoordinatanalyse vil bli utført ved bruk av UniFrac. Siden feil i pyrosekvensering forekommer med en hastighet på bare 0,25 %, vil de fleste av 400-nukleotidsekvensene som gjenstår etter filtrering inneholde enten 0 eller 1 feil. Dette nivået av sekvenseringsfeil vil ikke påvirke den taksonomiske analysen.

Det endelige datasettet for kolonmikrobiell taksonomisk analyse vil bli sammenlignet med 1.358.426-sekvens Ribosomal Database Project Release 10.

SEROTONIN TRANSPORTER POLYMORFISME For genotyping vil DNA bli isolert fra blodplater (fra venøst ​​blod) og kolonbiopsier ved standard fenol/kloroform ekstraksjon.

44-bp insersjons-/delesjonspolymorfismen i promoterregionen (SERT-P) vil bli analysert ved PCR av prøve-DNA med forover primer 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' og revers primer 5'-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3'. De forventede produktstørrelsene er henholdsvis 484 bp for sletting(er) og 528 bp for innsetting (l).

17-bp VNTR-polymorfismen til SERT-genintron 2 vil bli studert ved PCR av prøve-DNA med foroverprimer 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' og revers primer 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. De forventede produktstørrelsene for allelene 9, 10, 11 og 12 er henholdsvis 253bp, 270bp, 287bp og 304bp.

Kolon- og blodplate-SERT-proteinuttrykkene vil også bli studert ved sanntids PCR og western blot-metoden.