Manipulation af visceral overfølsomhed med probiotiske bakterier i irritabel tyktarm

Baggrund

En ufuldstændig forståelse af mekanismerne bag irritabel tyktarm (IBS) har hæmmet udviklingen af ​​en effektiv terapi for denne tilstand. Dette er længe ventet for en tilstand, der rammer mindst 20 procent af befolkningen (1), og som har stor indflydelse på patientens livskvalitet (2). Den nuværende forståelse af den underliggende ætiologi og patogenese af IBS er centreret omkring to niveauer: hjerne-tarm-aksen, som giver et billede af, hvordan stress, følelser og psykologiske tilstande alle ændrer opfattelsen af ​​IBS-symptomer. Inden for tarmvæggen omfatter de patofysiologiske mekanismer, der er impliceret i IBS, infektion, immunaktivering, dysmotilitet, unormal fermentering og visceral overfølsomhed. Undersøgelser har vist, at viscerale smertetærskler som reaktion på stress er lavere hos patienter med IBS sammenlignet med raske frivillige (3). Denne overfølsomhed er tydelig som reaktion på både en fysisk og kemisk stimulus, men triggerne til visceral overfølsomhed forbliver stort set ukendte. tarmbakterier spiller en væsentlig rolle i at inducere IBS. For eksempel udviklet post-infektiøs IBS i en undergruppe af patienter efter en anfald af gastroenteritis (4). Manipulation af den kommensale mikrobiota kan lindre IBS-symptomer, og der er nogle beviser for, at probiotiske præparater indeholdende visse bifidobakterier kan være særligt effektive (5). Dette forslag vil fokusere på yderligere udforskning af de mekanismer, der ligger til grund for visceral overfølsomhed over for direkte fremtidig målretning af terapi med probiotisk præparat.

Mål Formålet med denne undersøgelse er (i) at identificere IBS-associerede ændringer i tarmmikrobiota; (ii) at studere SERT-ekspression og genotypebestemmelse og deres forhold til tarmmikrobiotaen, og (iii) at bestemme, om probiotisk terapi ændrer visceral følsomhed hos IBS-patienter, og om probiotika-inducerede ændringer i visceral hypersensitivitet er forbundet med ændringer i tarmmikrobiotaen .

Hypotese Forskerne postulerer, at bakterier modulerer sensorisk afferent signalering og serotoninsignalering, hvilket er nødvendigt for visceral sensation, og at disse veje kan målrettes til behandling af IBS ved hjælp af probiotiske bakterier.

FORSKNINGSPLAN Denne undersøgelse består af to dele. Den første del vil være et tværsnitsstudie, der sammenligner colonmikrobiota og SERT-ekspression hos IBS-patienter og raske kontroller. Den anden del vil involvere et åbent pilotstudie for at vurdere virkningerne af orale probiotiske bakterier i visceral overfølsomhed, SERT-ekspression og slimhindemikrobiota hos patienter med IBS.

Baseline besøg Ti forsøgspersoner med IBS vil blive rekrutteret fra ambulatorier. Sygdommens sværhedsgrad vil blive bestemt ved tilmelding med et valideret IBS-symptomspørgeskema. Der vil blive opnået rutinemæssige blodprøver inklusive fuld blodtælling, biokemisk profil og C-reaktivt protein. Rektal følsomhed over for tryk og smerte vil blive vurderet med Barostat-apparatet. Barostat-anordning er blevet brugt i mange andre undersøgelser som et mål for visceral overfølsomhed. Udstyr til begge tests er i øjeblikket i brug på vores laboratorium. En baseline koloskopi vil blive udført og rektale biopsier vil blive taget. Ti kontroller, der gennemgår screening af koloskopi for polypper eller kolorektal cancer og efterfølgende viser sig at have en normal koloskopi, vil blive inkluderet for at deltage i FGI-Bx undersøgelsen, hvor deres vævsprøver vil blive brugt i denne undersøgelse.

Baseline prøver fra IBS:

1 rektalvæv (formalin fikseret til histologi) 2 rektalvæv (SERT polymorfisme) 3 rektalvæv (slimhindemikrobiota) 5 ml blod i EDTA rør (SERT polymorfisme)

Prøver fra kontroller:

1 rektalvæv (formalin fikseret til histologi) 2 rektalvæv (SERT polymorfisme) 3 rektalvæv (slimhindemikrobiota) 5 ml blod i EDTA rør (SERT polymorfisme)

Intervention IBS-patienter vil modtage VSL#3 (450 milliarder frysetørrede bakterier/pose) to gange dagligt i 4 uger. VSL#3 blev udvalgt til brug i denne undersøgelse, fordi (a) den indeholder tre forskellige Bifidobacteria-stammer (ud over lactobacilli og streptokokker) og den begrænsede evidens, der er tilgængelig, Bifidobacteria som de mest effektive probiotika ved IBS (13). Et flowdiagram for undersøgelsen findes i bilag 1.

Uge 4 Vurdering

Klinisk respons på probiotisk behandling Vurderinger vil blive foretaget ved baseline og på dag 28 af behandlingen. De tre symptomer på IBS vil blive vurderet for at bestemme respons på terapi: mavesmerter/ubehag, oppustethed/udspilning og afføring, hver scoret på en ordinær skala (Likert-skala; maksimal score 7) og på en 100 mm visuel analog skala (VAS; maksimal score 100). En sammensat score med summen af ​​de 3 kardinalsymptomer vil også blive beregnet for hver patient (Likert-skalaen maksimal score 21) (VAS; maksimal score 300). Gentagen rektal følsomhedstest vil blive udført.

Ændringer i slimhindemikrobiota som reaktion på probiotisk behandling. Vurderinger vil blive foretaget ved baseline og på dag 28. På grund af den noget invasive karakter af en gentagen koloskopi, vil efterforskerne kun udføre en fleksibel sigmoidoskopi for at opnå rektale biopsier efter probiotisk behandling.

Uge 4 prøver fra IBS:

1. rektalvæv (formalin fikseret til histologi)
2. rektalvæv (SERT polymorfisme)
3. rektalvæv (slimhindemikrobiota)

5 ml blod i EDTA (SERT polymorfisme)

Seks måneders opfølgning Patienter vil blive kontaktet efter 6 måneder for at revurdere symptomscore for at bestemme langsigtet effekt af behandlingen.

KOLONOSKOPI Koloskopi vil blive udført som et ambulant indgreb under bevidst sedation med intravenøs diazepam og pethidin. Forsøgspersoner vil modtage tarmforberedelse med PEG. Ved fleksibel sigmoidoskopi udføres en uforberedt undersøgelse, og der vil blive taget fire biopsier 15 cm fra analkanten.

RECTAL BAROSTAT Barostat-enheden indeholder et indbygget computersystem, der kan programmeres til automatisk at udføre udspilninger af ballonen med faste tidsforsinkelser og posetrykstigninger. Variation i ballonvolumen i et konstant tryk afspejler ændringen i tone og compliance af den viscerale væg. Ydermere, gennem en programmeret variation i intraballontrykket, kan individets sensoriske tærskel evalueres.

Patienten instrueres i at administrere 4,5 fl oz natriumphosphater rektalt 4 timer før undersøgelse derhjemme til rektal rensning. Efter en 3-timers faste vil deltageren blive placeret i venstre sideleje. En barostatpose indsættes i endetarmen. Barostatanordningen er forbundet til barostatkateteret ved hjælp af en PVC-slange med lav overensstemmelse.

Efter 10 minutters hvile udføres fasiske isobariske rektale udspilninger automatisk ved hjælp af ascending method of limits (AML) protokol med successive trin på 4 mm Hg (40 sekunders varighed), alternerende med intermitterende perioder med tømning af posen (40 sekunder). Under hver udspilningsfase anmodes deltageren om at rapportere perceptionsvurderingerne ved at trykke på perceptionspanelet på barostatanordningen med følgende skala: (1) Ingen fornemmelse af ballonudspilning, (2) den første fornemmelse af ballonudspilning, (3) ønske om afføring, (4) maksimal tolerabel fornemmelse. Proceduren vil blive stoppet, når smerte eller maksimal tolerabel fornemmelse rapporteres. Den sensoriske tærskel er defineret som den nedre grænse for posetrykket, der fremkalder den første fornemmelse af ballonudspilning. Smertetærsklen er defineret som tryk, der fremkalder en "smerte"-reaktion eller maksimal tolerabel fornemmelse.

MUCOSAL MICROBIOTA Der vil blive taget tyktarmsprøver for at repræsentere adhærent bakterieflora. Alle prøver vil blive opbevaret ved -80 grader Celsius indtil brug. Hver prøve sættes til rør, der indeholder 500 µl phenol: Chloroform: isoamylalkohol (24:24:1) og 500 µl 0,1 mm diameter zirconia/silica-perler (Biospec Products, Barthesville, OK). Mikrobielle celler vil blive forstyrret mekanisk ved 23 grader Celsius med en perlevisker (Biospec Products, instrument indstillet på høj i 2 minutter). Isoleret DNA vil blive fraktioneret ved elektroforese gennem 1% agarosegeler, og det dominerende bånd vil blive oprenset med MiniElute Gel Extraction kit (Qiagen).

Amplifikation af de bakterielle 16S ribosomale RNA-sekvenser til pyrosekventering vil blive udført ved PCR. For hver prøve vil 100-200 mg oprenset genomisk DNA blive amplificeret ved at bruge primere BSR357-A og BSF8-B, som annealer til konserverede områder af bakterielt 16s rRNA-gen. PCR-produkterne vil blive sekventeret ved hjælp af 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX-systemet (leveret af Det Naturvidenskabelige Fakultet, CUHK). Kvalitetskontrol vil blive opnået ved følgende kriterier: sekvensen skal (i) vise et perfekt match til stregkoden og 16S ribosomal RNA-genprimeren, (ii) være mindst 50 nukleotider lang, (iii) ikke have mere end to ubestemte baser i den aflæste sekvens, og (iv) har mindst 75 % match til en tidligere bestemt 16S ribosomal RNA-gensekvens. Operationel taksonomisk enhed (OTU) klynge og analyse vil blive udført ved hjælp af OTUPicker. Clustering og principal koordinatanalyse vil blive udført ved hjælp af UniFrac. Da fejl i pyrosequencing forekommer med en hastighed på kun 0,25%, vil de fleste af de 400-nukleotidsekvenser, der er tilbage efter filtrering, indeholde enten 0 eller 1 fejl. Dette niveau af sekventeringsfejl vil ikke påvirke den taksonomiske analyse.

Det endelige datasæt til mikrobiel taksonomisk analyse i tyktarmen vil blive sammenlignet med 1.358.426-sekvens Ribosomal Database Project Release 10.

SEROTONIN TRANSPORTER POLYMORFISME Til genotypebestemmelse vil DNA blive isoleret fra blodplader (fra venøst ​​blod) og kolonbiopsier ved standard phenol/chloroform ekstraktion.

44-bp insertions-/deletionspolymorfien i promotorregionen (SERT-P) vil blive analyseret ved PCR af prøve-DNA med fremadgående primer 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' og omvendt primer 5'-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3'. De forventede produktstørrelser er henholdsvis 484 bp for deletion(er) og 528 bp for insertion (l).

17-bp VNTR polymorfien af ​​SERT gen intron 2 vil blive undersøgt ved PCR af prøve-DNA med fremad primer 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' og omvendt primer 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. De forventede produktstørrelser for allelerne 9, 10, 11 og 12 er henholdsvis 253bp, 270bp, 287bp og 304bp.

Kolon- og blodplade-SERT-proteinekspressionerne vil også blive undersøgt ved real-time PCR og western blot-metoden.