用益生菌控制肠易激综合征的内脏高敏感性

背景

对肠易激综合征 (IBS) 潜在机制的不完全理解阻碍了针对这种情况的有效治疗的发展。 对于影响至少 20% 的人口 (1) 并且对患者的生活质量 (QOL) 有重大影响 (2) 的疾病来说，这是早就应该进行的。目前对 IBS 潜在病因和发病机制的理解集中在两个层次：脑-肠轴，它提供了压力、情绪和心理状况如何改变 IBS 症状感知的概念。 在肠壁内，与 IBS 相关的病理生理机制包括感染、免疫激活、运动障碍、异常发酵和内脏超敏反应。 研究表明，与健康志愿者相比，IBS 患者应对压力的内脏痛阈值较低 (3)。 这种超敏反应在对物理和化学刺激的反应中是显而易见的，但内脏超敏反应的诱因在很大程度上仍然未知。 肠道细菌在诱发 IBS 中起重要作用。 例如，感染后 IBS 在胃肠炎发作后的一组患者中发展 (4)。 控制共生菌群可以缓解 IBS 症状，并且有证据表明含有某些双歧杆菌的益生菌制剂可能特别有效 (5)。 该提案将着重于进一步探索内脏超敏反应的潜在机制，以指导未来益生菌制剂治疗的靶向。

目的 本研究的目的是 (i) 确定 IBS 相关的肠道菌群变化； (ii) 研究 SERT 表达和基因分型，以及它们与肠道微生物群的关系，以及 (iii) 确定益生菌疗法是否改变 IBS 患者的内脏敏感性，以及益生菌引起的内脏高敏感性变化是否与肠道微生物群的变化相关.

假设 研究人员假设细菌调节感觉传入信号和血清素信号，这是内脏感觉所必需的，并且这些途径可以作为使用益生菌治疗 IBS 的目标。

研究计划 本研究由两部分组成。 第一部分将是一项横断面研究，比较 IBS 患者和健康对照者的结肠微生物群和 SERT 表达。 第二部分将涉及一项试点开放标签研究，以评估口服益生菌对 IBS 患者内脏超敏反应、SERT 表达和粘膜微生物群的影响。

基线访视将从门诊诊所招募十名患有 IBS 的受试者。 疾病严重程度将在入组时使用经过验证的 IBS 症状问卷来确定。 将获得常规血液检查，包括全血细胞计数、生化特征和 C 反应蛋白。 直肠对压力和疼痛的敏感性将使用恒压器装置进行评估。 恒压器装置已在许多其他研究中用作内脏超敏反应的量度。 我们的实验室目前正在使用这两项测试的设备。 将进行基线结肠镜检查并进行直肠活检。 十名接受息肉或结直肠癌筛查结肠镜检查并随后发现结肠镜检查正常的对照将被纳入 FGI-Bx 研究，他们的组织样本将用于本研究。

来自 IBS 的基线样本：

1 个直肠组织（福尔马林固定用于组织学） 2 个直肠组织（SERT 多态性） 3 个直肠组织（粘膜微生物群） EDTA 试管中的 5ml 血液（SERT 多态性）

来自对照的样本：

1 个直肠组织（福尔马林固定用于组织学） 2 个直肠组织（SERT 多态性） 3 个直肠组织（粘膜微生物群） EDTA 试管中的 5ml 血液（SERT 多态性）

干预 IBS 患者将每天两次接受 VSL#3（4500 亿冻干细菌/小袋），持续 4 周。 选择 VSL#3 用于本研究，因为 (a) 它包含三种不同的双歧杆菌菌株（除了乳杆菌和链球菌）以及双歧杆菌作为 IBS 中最有效益生菌的有限证据 (13)。 该研究的流程图见附录 1。

第 4 周评估

对益生菌治疗的临床反应将在基线和治疗第 28 天进行评估。 将评估 IBS 的三种症状以确定对治疗的反应：腹痛/不适、腹胀/腹胀和排便，每项症状均按顺序量表（李克特量表；最高分 7）和 100mm 视觉模拟量表（VAS；最高分 100）。 还将为每位患者计算具有 3 种主要症状总和的综合评分（李克特量表最高评分 21）（VAS；最高评分 300）。 将进行重复的直肠敏感性测试。

粘膜微生物群响应益生菌治疗的变化将在基线和第 28 天进行评估。 由于重复结肠镜检查具有一定的侵入性，研究人员将仅在益生菌治疗后进行灵活的乙状结肠镜检查以获得直肠活检。

来自 IBS 的第 4 周样本：

1. 直肠组织（固定用于组织学的福尔马林）
2. 直肠组织（SERT多态性）
3. 直肠组织（粘膜微生物群）

EDTA 中的 5ml 血液（SERT 多态性）

六个月随访 将在 6 个月时联系患者以重新评估症状评分以确定治疗的长期影响。

结肠镜检查 结肠镜检查将作为门诊手术在静脉注射地西泮和哌替啶进行清醒镇静的情况下进行。 受试者将接受使用 PEG 的肠道准备。 对于可弯曲乙状结肠镜检查，将进行无准备的检查，并在距肛缘 15 厘米处进行四次活检。

直肠恒压器 恒压器设备包含一个内置的计算机系统，可以对其进行编程以自动执行具有固定时间滞后和袋压力增量的气球扩张。 在恒定压力下球囊体积的变化反映了内脏壁的张力和顺应性的变化。 此外，通过球囊内压力的程序化变化，可以评估受试者的感觉阈值。

指示患者在家中研究直肠清洁前 4 小时直肠给药 4.5 液量盎司磷酸钠。 禁食 3 小时后，参与者将处于左侧卧位。 将恒压袋插入直肠。 恒压器设备使用低顺应性 PVC 管连接到恒压器导管。

休息 10 分钟后，使用限值递增法 (AML) 协议自动执行阶段性等压直肠扩张，连续增加 4 毫米汞柱（持续 40 秒）与间歇性袋放气（40 秒）交替进行。 在每个扩张阶段，要求参与者通过按下具有以下等级的恒压装置的感知面板来报告感知等级：（1）没有气球扩张的感觉，（2）气球扩张的第一感觉，（3）排便的欲望，（4）最大可容忍的感觉。 当报告疼痛或最大可忍受的感觉时，程序将停止。 感觉阈值被定义为引起球囊膨胀的第一感觉的袋压力的下限。 疼痛阈值被定义为引起“疼痛”反应或最大可耐受感觉的压力。

粘膜微生物群 取结肠样品以代表粘附菌群。 所有样品将储存在-80 摄氏度直至使用。 将每个样品添加到含有 500µl 苯酚：氯仿：异戊醇 (24:24:1) 和 500µl 0.1mm 直径氧化锆/二氧化硅珠（Biospec Products, Barthesville, OK）的试管中。 微生物细胞将在 23 摄氏度下用珠磨机（Biospec Products，仪器设置为高 2 分钟）机械破碎。 分离的 DNA 将通过 1% 琼脂糖凝胶电泳分离，主要条带将通过 MiniElute 凝胶提取试剂盒（Qiagen）纯化。

用于焦磷酸测序的细菌 16S 核糖体 RNA 序列的扩增将通过 PCR 进行。 对于每个样本，将使用引物 BSR357-A 和 BSF8-B 扩增 100-200mg 纯化的基因组 DNA，这些引物与细菌 16s rRNA 基因的保守区域退火。 PCR产物将使用454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX系统（由香港中文大学理学院提供）进行测序。 质量控制将通过以下标准实现：序列应 (i) 显示与条形码和 16S 核糖体 RNA 基因引物完美匹配，(ii) 长度至少为 50 个核苷酸，(iii) 不超过两个序列读取中未确定的碱基，以及 (iv) 与先前确定的 16S 核糖体 RNA 基因序列至少有 75% 的匹配度。 操作分类单元 (OTU) 聚类和分析将使用 OTUPicker 进行。 将使用 UniFrac 进行聚类和主坐标分析。 由于焦磷酸测序中的错误发生率仅为 0.25%，过滤后剩余的 400 个核苷酸序列中的大部分将包含 0 或 1 个错误。 这种级别的测序错误不会影响分类分析。

结肠微生物分类学分析的最终数据集将与 1,358,426 序列核糖体数据库项目第 10 版进行比较。

5-羟色胺转运蛋白多态性 对于基因分型，将通过标准苯酚/氯仿提取从血小板（来自静脉血）和结肠活检组织中分离 DNA。

将使用正向引物 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' 和反向引物 5'-GGC GTT 通过样品 DNA 的 PCR 分析启动子区域 (SERT-P) 中的 44-bp 插入/缺失多态性GCC GCT CTG AAT GC-3'。 预期的产品大小分别为删除 (s) 484 bp 和插入 (l) 528 bp。

将使用正向引物 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' 和反向引物 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 对样本 DNA 进行 PCR 研究 SERT 基因内含子 2 的 17-bp VNTR 多态性'. 等位基因 9、10、11 和 12 的预期产物大小分别为 253bp、270bp、287bp 和 304bp。

还将通过实时 PCR 和蛋白质印迹法研究结肠和血小板 SERT 蛋白表达。