Manipolazione dell'ipersensibilità viscerale con batteri probiotici nella sindrome dell'intestino irritabile

Sfondo

Una comprensione incompleta dei meccanismi alla base della sindrome dell'intestino irritabile (IBS) ha ostacolato lo sviluppo di una terapia efficace per questa condizione. Ciò è atteso da tempo per una condizione che colpisce almeno il 20% della popolazione (1) e ha un impatto importante sulla qualità della vita (QOL) del paziente (2). L'attuale comprensione dell'eziologia sottostante e della patogenesi dell'IBS è incentrata su due livelli: l'asse cervello-intestino che fornisce il concetto di come lo stress, l'emozione e le condizioni psicologiche alterano la percezione dei sintomi dell'IBS. All'interno della parete intestinale, i meccanismi fisiopatologici implicati nell'IBS comprendono l'infezione, l'attivazione immunitaria, la dismotilità, la fermentazione anomala e l'ipersensibilità viscerale. Gli studi hanno dimostrato che le soglie del dolore viscerale in risposta allo stress sono inferiori nei pazienti con IBS rispetto ai volontari sani (3). Questa ipersensibilità è evidente in risposta sia a uno stimolo fisico che chimico, ma i fattori scatenanti dell'ipersensibilità viscerale rimangono in gran parte sconosciuti. i batteri intestinali svolgono un ruolo significativo nell'indurre l'IBS. Ad esempio l'IBS post-infettiva si è sviluppata in un sottogruppo di pazienti a seguito di un attacco di gastroenterite (4). La manipolazione del microbiota commensale può alleviare i sintomi dell'IBS e ci sono alcune prove che i preparati probiotici contenenti alcuni bifidobatteri possono essere particolarmente efficaci (5). Questa proposta si concentrerà su un'ulteriore esplorazione dei meccanismi alla base dell'ipersensibilità viscerale per indirizzare il futuro targeting della terapia con preparazione probiotica.

Obiettivi Gli obiettivi di questo studio sono (i) identificare i cambiamenti associati all'IBS nel microbiota intestinale; (ii) studiare l'espressione e la genotipizzazione del SERT e la loro relazione con il microbiota intestinale e (iii) determinare se la terapia probiotica altera la sensibilità viscerale nei pazienti con IBS e se i cambiamenti indotti dai probiotici nell'ipersensibilità viscerale sono associati a cambiamenti nel microbiota intestinale .

Ipotesi I ricercatori postulano che i batteri modulino la segnalazione afferente sensoriale e la segnalazione della serotonina, necessarie per la sensazione viscerale e che questi percorsi possono essere presi di mira per la terapia dell'IBS utilizzando batteri probiotici.

PIANO DI RICERCA Questo studio si compone di due parti. La prima parte sarà uno studio trasversale che confronta il microbiota del colon e l'espressione di SERT nei pazienti con IBS e nei controlli sani. La seconda parte riguarderà uno studio pilota in aperto per valutare gli effetti dei batteri probiotici orali sull'ipersensibilità viscerale, l'espressione di SERT e il microbiota della mucosa nei pazienti con IBS.

Visita di riferimento Dieci soggetti con IBS saranno reclutati dalle cliniche ambulatoriali. La gravità della malattia sarà determinata al momento dell'arruolamento con un questionario sui sintomi dell'IBS convalidato. Saranno ottenuti esami del sangue di routine tra cui emocromo completo, profilo biochimico e proteina C-reattiva. La sensibilità rettale alla pressione e al dolore sarà valutata con il dispositivo Barostat. Il dispositivo Barostat è stato utilizzato in molti altri studi come misura dell'ipersensibilità viscerale. Le apparecchiature per entrambi i test sono attualmente in uso presso il nostro laboratorio. Verrà eseguita una colonscopia di base e verranno prelevate biopsie rettali. Dieci controlli sottoposti a colonscopia di screening per polipi o cancro del colon-retto e successivamente trovati con una colonscopia normale saranno inclusi per partecipare allo studio FGI-Bx, in cui i loro campioni di tessuto verrebbero utilizzati in questo studio.

Campioni basali da IBS:

1 tessuto rettale (fissato in formalina per istologia) 2 tessuti rettali (polimorfismo SERT) 3 tessuti rettali (microbiota della mucosa) 5 ml di sangue in provetta EDTA (polimorfismo SERT)

Campioni dai controlli:

1 tessuto rettale (fissato in formalina per istologia) 2 tessuti rettali (polimorfismo SERT) 3 tessuti rettali (microbiota della mucosa) 5 ml di sangue in provetta EDTA (polimorfismo SERT)

Intervento I pazienti con IBS riceveranno VSL#3 (450 miliardi di batteri liofilizzati/bustina) due volte al giorno per 4 settimane. VSL#3 è stato selezionato per l'uso in questo studio perché (a) contiene tre diversi ceppi di bifidobatteri (oltre a lattobacilli e streptococchi) e le limitate prove disponibili sui bifidobatteri come probiotici più efficaci nell'IBS (13). Un diagramma di flusso dello studio si trova nell'appendice 1.

Settimana 4 Valutazione

Risposta clinica alla terapia con probiotici Le valutazioni saranno effettuate al basale e al giorno 28 della terapia. I tre sintomi dell'IBS saranno valutati per determinare la risposta alla terapia: dolore/fastidio addominale, gonfiore/distensione e movimenti intestinali, ciascuno valutato su una scala ordinale (scala Likert; punteggio massimo 7) e su una scala analogica visiva di 100 mm (VAS; punteggio massimo 100). Per ogni paziente verrà inoltre calcolato un punteggio composito con le somme dei 3 sintomi cardinali (punteggio massimo scala Likert 21) (VAS; punteggio massimo 300). Verrà eseguito il test di sensibilità rettale ripetuto.

Cambiamenti nel microbiota della mucosa in risposta alla terapia probiotica Le valutazioni saranno effettuate al basale e al giorno 28. A causa della natura alquanto invasiva di una colonscopia ripetuta, gli investigatori eseguiranno solo una sigmoidoscopia flessibile per ottenere biopsie rettali dopo il trattamento probiotico.

Campioni della settimana 4 da IBS:

1. tessuto rettale (fissato in formalina per istologia)
2. tessuti rettali (polimorfismo SERT)
3. tessuti rettali (microbiota della mucosa)

5 ml di sangue in EDTA (polimorfismo SERT)

Follow-up di sei mesi I pazienti verranno contattati a 6 mesi per rivalutare i punteggi dei sintomi per determinare l'impatto a lungo termine della terapia.

COLONOSCOPIA La colonscopia verrà eseguita in regime ambulatoriale in sedazione cosciente con diazepam e petidina per via endovenosa. I soggetti riceveranno la preparazione intestinale con PEG. Per la sigmoidoscopia flessibile, verrà eseguito un esame non preparato e verranno ottenute quattro biopsie a 15 cm dal margine anale.

BAROSTATO RETTALE Il dispositivo barostato contiene un sistema informatico integrato che può essere programmato per eseguire automaticamente distensioni del palloncino con intervalli di tempo fissi e incrementi della pressione della sacca. La variazione del volume del palloncino a pressione costante riflette il cambiamento di tono e di compliance della parete viscerale. Inoltre, attraverso una variazione programmata della pressione intrapalloncino, è possibile valutare la soglia sensoriale del soggetto.

Al paziente viene chiesto di somministrare 4,5 fl oz di fosfati di sodio per via rettale 4 ore prima dello studio a casa per la pulizia rettale. Dopo un digiuno di 3 ore, il partecipante verrà posizionato in posizione laterale sinistra. Una sacca barostatica viene inserita nel retto. Il dispositivo barostatico è collegato al catetere barostatico mediante un tubo in PVC a bassa compliance.

Dopo 10 minuti di riposo, le distensioni rettali isobariche fasiche vengono eseguite automaticamente utilizzando il protocollo del metodo ascendente dei limiti (AML) con incrementi successivi di 4 mm Hg (durata di 40 secondi) alternati a periodi intermittenti di sgonfiaggio del sacco (40 secondi). Durante ogni fase di distensione, al partecipante viene richiesto di riportare le valutazioni di percezione premendo sul pannello di percezione del dispositivo barostatico con la seguente scala: (1) nessuna sensazione di distensione del palloncino, (2) la prima sensazione di distensione del palloncino, (3) desiderio di defecazione, (4) massima sensazione tollerabile. La procedura verrà interrotta quando viene segnalato il dolore o la massima sensazione tollerabile. La soglia sensoriale è definita come limite inferiore della pressione del pallone che evoca la prima sensazione di distensione del palloncino. La soglia del dolore è definita come la pressione che suscita una risposta "dolorosa" o la massima sensazione tollerabile.

MICROBIOTA DELLA MUCOSA Saranno prelevati campioni di colon per rappresentare la flora batterica aderente. Tutti i campioni verranno conservati a -80 gradi Celsius fino all'utilizzo. Ciascun campione verrà aggiunto a provette contenenti 500 µl di fenolo: cloroformio: alcol isoamilico (24:24:1) e 500 µl di sfere di zirconia/silice da 0,1 mm di diametro (Biospec Products, Barthesville, OK). Le cellule microbiche verranno distrutte meccanicamente a 23 gradi Celsius con un battitore di perline (Biospec Products, strumento impostato su alto per 2 minuti). Il DNA isolato sarà frazionato mediante elettroforesi attraverso gel di agarosio all'1%, e la banda dominante sarà purificata mediante il kit MiniElute Gel Extraction (Qiagen).

L'amplificazione delle sequenze di RNA ribosomiale 16S batterico per il pirosequenziamento sarà eseguita mediante PCR. Per ogni campione, 100-200 mg di DNA genomico purificato saranno amplificati utilizzando i primer BSR357-A e BSF8-B, che si associano alle regioni conservate del gene batterico 16s rRNA. I prodotti della PCR saranno sequenziati utilizzando il sistema 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX (fornito dalla Faculty of Science, CUHK). Il controllo di qualità sarà ottenuto in base ai seguenti criteri: la sequenza dovrebbe (i) mostrare una corrispondenza perfetta con il codice a barre e il primer del gene dell'RNA ribosomiale 16S, (ii) avere una lunghezza di almeno 50 nucleotidi, (iii) non avere più di due basi indeterminate nella sequenza letta, e (iv) hanno una corrispondenza di almeno il 75% con una sequenza del gene dell'RNA ribosomiale 16S precedentemente determinata. Il clustering e l'analisi delle unità tassonomiche operative (OTU) saranno effettuati utilizzando OTUPicker. Il clustering e l'analisi delle coordinate principali saranno condotti utilizzando UniFrac. Poiché gli errori nel pirosequenziamento si verificano a un tasso di solo lo 0,25%, la maggior parte delle sequenze di 400 nucleotidi che rimangono dopo il filtraggio conterranno 0 o 1 errore. Questo livello di errore di sequenziamento non influirà sull'analisi tassonomica.

Il set di dati finale per l'analisi tassonomica microbica del colon verrà confrontato con il Ribosomal Database Project Release 10 di 1.358.426 sequenze.

POLIMORFISMO DEL TRASPORTATORE DELLA SEROTONINA Per la genotipizzazione, il DNA sarà isolato dalle piastrine del sangue (dal sangue venoso) e dalle biopsie del colon mediante estrazione standard con fenolo/cloroformio.

Il polimorfismo di inserzione/delezione a 44 bp nella regione del promotore (SERT-P) sarà analizzato mediante PCR del campione di DNA con forward primer 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' e reverse primer 5'-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3'. Le dimensioni del prodotto previste sono rispettivamente di 484 bp per la delezione (s) e di 528 bp per l'inserimento (l).

Il polimorfismo VNTR a 17 bp dell'introne 2 del gene SERT sarà studiato mediante PCR di campioni di DNA con forward primer 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' e reverse primer 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. Le dimensioni del prodotto previste per gli alleli 9, 10, 11 e 12 sono rispettivamente di 253 bp, 270 bp, 287 bp e 304 bp.

L'espressione della proteina SERT nel colon e nelle piastrine sarà inoltre studiata mediante real time PCR e metodi western blot.