Manipulatie van viscerale overgevoeligheid met probiotische bacteriën bij het prikkelbare darmsyndroom

Achtergrond

Een onvolledig begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het prikkelbare darm syndroom (PDS) heeft de ontwikkeling van een effectieve therapie voor deze aandoening belemmerd. Dit is lang geleden voor een aandoening die ten minste 20 procent van de bevolking treft (1) en een grote invloed heeft op de kwaliteit van leven (QOL) van de patiënt (2). Het huidige begrip van de onderliggende etiologie en pathogenese van IBS is gericht op twee niveaus: de hersen-darm-as die een idee geeft van hoe stress, emotie en psychologische aandoeningen allemaal de perceptie van IBS-symptomen veranderen. Binnen de darmwand omvatten de pathofysiologische mechanismen die betrokken zijn bij IBS infectie, immuunactivering, dysmotiliteit, abnormale gisting en viscerale overgevoeligheid. Studies hebben aangetoond dat viscerale pijndrempels als reactie op stress lager zijn bij patiënten met IBS in vergelijking met gezonde vrijwilligers (3). Deze overgevoeligheid is duidelijk als reactie op zowel een fysieke als een chemische stimulus, maar de triggers voor viscerale overgevoeligheid blijven grotendeels onbekend. darmbacteriën spelen een belangrijke rol bij het induceren van IBS. Zo ontwikkelde post-infectieuze IBS zich in een subgroep van patiënten na een aanval van gastro-enteritis (4). Manipulatie van de commensale microbiota kan IBS-symptomen verlichten en er zijn aanwijzingen dat probiotische preparaten die bepaalde Bifidobacteriën bevatten bijzonder effectief kunnen zijn (5). Dit voorstel zal zich richten op verdere verkenning van de mechanismen die ten grondslag liggen aan viscerale overgevoeligheid om toekomstige therapie met probiotische preparaten te sturen.

Doelstellingen De doelstellingen van deze studie zijn (i) het identificeren van IBS-geassocieerde veranderingen in darmmicrobiota; (ii) om SERT-expressie en genotypering te bestuderen, en hun relatie met de darmmicrobiota, en (iii) om te bepalen of probiotische therapie de viscerale gevoeligheid bij IBS-patiënten verandert en of probiotica-geïnduceerde veranderingen in viscerale overgevoeligheid geassocieerd zijn met veranderingen in de darmmicrobiota .

Hypothese De onderzoekers veronderstellen dat bacteriën sensorische afferente signalering en serotonine-signalering moduleren, noodzakelijk voor viscerale sensatie, en dat deze routes het doelwit kunnen zijn voor therapie van IBS met behulp van probiotische bacteriën.

ONDERZOEKSPLAN Dit onderzoek bestaat uit twee delen. Het eerste deel zal een cross-sectionele studie zijn die de colonmicrobiota en SERT-expressie bij IBS-patiënten en gezonde controles vergelijkt. Het tweede deel omvat een pilot open-label studie om de effecten van orale probiotische bacteriën op viscerale overgevoeligheid, SERT-expressie en mucosale microbiota bij patiënten met IBS te beoordelen.

Basislijnbezoek Tien proefpersonen met IBS zullen worden gerekruteerd uit poliklinieken. De ernst van de ziekte zal worden bepaald bij inschrijving met een gevalideerde IBS-symptoomvragenlijst. Routinematige bloedtesten inclusief volledig bloedbeeld, biochemisch profiel en C-reactief proteïne zullen worden verkregen. De rectale gevoeligheid voor druk en pijn wordt beoordeeld met het Barostat-apparaat. Het Barostat-apparaat is in veel andere onderzoeken gebruikt als maat voor viscerale overgevoeligheid. Apparatuur voor beide tests is momenteel in gebruik in ons laboratorium. Er zal een baseline colonoscopie worden uitgevoerd en er zullen rectale biopsieën worden genomen. Tien controles die screening colonoscopie ondergaan voor poliepen of darmkanker en vervolgens een normale colonoscopie blijken te hebben, zullen worden opgenomen om deel te nemen aan de FGI-Bx-studie, waarin hun weefselmonsters in deze studie zouden worden gebruikt.

Basislijnmonsters van IBS:

1 rectaal weefsel (formaline gefixeerd voor histologie) 2 rectale weefsels (SERT-polymorfisme) 3 rectale weefsels (mucosale microbiota) 5 ml bloed in EDTA-buis (SERT-polymorfisme)

Voorbeelden van controles:

1 rectaal weefsel (formaline gefixeerd voor histologie) 2 rectale weefsels (SERT-polymorfisme) 3 rectale weefsels (mucosale microbiota) 5 ml bloed in EDTA-buis (SERT-polymorfisme)

Interventie PDS-patiënten krijgen gedurende 4 weken tweemaal daags VSL#3 (450 miljard gelyofiliseerde bacteriën/zakje). VSL#3 werd geselecteerd voor gebruik in dit onderzoek omdat (a) het drie verschillende Bifidobacteria-stammen bevat (naast lactobacillen en streptokokken) en het beperkte bewijs dat beschikbaar is Bifidobacteriën als de meest effectieve probiotica bij PDS (13) . Een stroomschema van het onderzoek is te vinden in bijlage 1.

Beoordeling week 4

Klinische respons op probiotische therapie Er zullen beoordelingen worden gemaakt bij baseline en op dag 28 van de therapie. De drie symptomen van IBS zullen worden beoordeeld om de respons op de therapie te bepalen: buikpijn/ongemak, opgeblazen gevoel/uitzetting en stoelgang, elk gescoord op een ordinale schaal (Likert-schaal; maximale score 7) en op een 100 mm visuele analoge schaal (VAS; maximale score 100). Voor elke patiënt wordt ook een samengestelde score met de som van de 3 kardinale symptomen berekend (Likertschaal maximale score 21) (VAS; maximale score 300). Herhaalde rectale gevoeligheidstests zullen worden uitgevoerd.

Veranderingen in mucosa-microbiota als reactie op probiotische therapie Er zullen beoordelingen worden gemaakt bij baseline en op dag 28. Vanwege het enigszins invasieve karakter van een herhaalde colonoscopie, zullen de onderzoekers alleen een flexibele sigmoïdoscopie uitvoeren om rectale biopsieën te verkrijgen na probiotische behandeling.

Week 4 monsters van IBS:

1. rectaal weefsel (formaline gefixeerd voor histologie)
2. rectale weefsels (SERT-polymorfisme)
3. rectale weefsels (mucosale microbiota)

5 ml bloed in EDTA (SERT-polymorfisme)

Zes maanden follow-up Patiënten zullen na 6 maanden worden gecontacteerd om de symptoomscores opnieuw te beoordelen om de impact van de therapie op langere termijn te bepalen.

COLONOSCOPY Colonoscopie wordt uitgevoerd als een poliklinische procedure onder bewuste sedatie met intraveneus diazepam en pethidine. Proefpersonen krijgen darmvoorbereiding met PEG. Voor flexibele sigmoïdoscopie wordt een onvoorbereid onderzoek uitgevoerd en worden vier biopsieën genomen op 15 cm van de anale rand.

RECTAL BAROSTAT Het barostaatapparaat bevat een ingebouwd computersysteem dat kan worden geprogrammeerd om automatisch uitzettingen van de ballon uit te voeren met vaste tijdvertragingen en verhogingen van de zakdruk. Variatie in ballonvolume bij constante druk weerspiegelt de verandering in toon en compliantie van de viscerale wand. Bovendien kan door een geprogrammeerde variatie in intraballondruk de sensorische drempel van het onderwerp worden geëvalueerd.

De patiënt wordt geïnstrueerd om 4,5 fl oz natriumfosfaten rectaal toe te dienen 4 uur voor het onderzoek thuis voor rectale reiniging. Na 3 uur vasten wordt de deelnemer in de linker laterale positie geplaatst. Een barostaatzak wordt in de endeldarm ingebracht. Het barostaatapparaat is verbonden met de barostaatkatheter met behulp van een PVC-slang met lage flexibiliteit.

Na 10 minuten rust worden fasische isobare rectale distensies automatisch uitgevoerd met behulp van het protocol van de oplopende methode van limieten (AML) met opeenvolgende stappen van 4 mm Hg (duur van 40 seconden) afgewisseld met intermitterende perioden van leeglopen van de zak (40 seconden). Tijdens elke uitzettingsfase wordt de deelnemer verzocht om de waarnemingsbeoordelingen te rapporteren door op het waarnemingspaneel van het barostaatapparaat te drukken met de volgende schaal: (1) Geen gevoel van ballonuitzetting, (2) het eerste gevoel van ballonuitzetting, (3) verlangen naar ontlasting, (4) maximaal draaglijk gevoel. De procedure wordt gestopt wanneer pijn of maximaal draaglijk gevoel wordt gemeld. De sensorische drempel wordt gedefinieerd als de ondergrens van de zakdruk die het eerste gevoel van ballonuitzetting oproept. De pijndrempel wordt gedefinieerd als druk die een "pijn"-reactie of maximaal verdraagbare sensatie oproept.

MUCOSALE MICROBIOTA Colonmonsters zullen worden genomen om aanhangende bacteriële flora weer te geven. Alle monsters worden tot gebruik bewaard bij -80 graden Celsius. Elk monster zal worden toegevoegd aan buisjes die 500 µl fenol: chloroform: isoamylalcohol (24:24:1) en 500 µl zirkonia/silicaparels met een diameter van 0,1 mm bevatten (Biospec Products, Barthesville, OK). Microbiële cellen worden bij 23 graden Celsius mechanisch opengebroken met een parelklopper (Biospec Products, instrument gedurende 2 minuten op hoog). Geïsoleerd DNA wordt gefractioneerd door elektroforese door 1% agarosegels en de dominante band wordt gezuiverd door MiniElute Gel Extraction kit (Qiagen).

Amplificatie van de bacteriële 16S ribosomale RNA-sequenties voor pyrosequencing zal worden uitgevoerd door middel van PCR. Voor elk monster wordt 100-200 mg gezuiverd genomisch DNA geamplificeerd door gebruik te maken van de primers BSR357-A en BSF8-B, die hechten aan geconserveerde gebieden van het bacteriële 16s-rRNA-gen. De PCR-producten zullen worden gesequenced met behulp van het 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX-systeem (geleverd door Faculty of Science, CUHK). Kwaliteitscontrole wordt bereikt door de volgende criteria: de sequentie moet (i) perfect overeenkomen met de streepjescode en de 16S ribosomale RNA-genprimer, (ii) ten minste 50 nucleotiden lang zijn, (iii) niet meer dan twee onbepaalde basen in de gelezen sequentie, en (iv) voor ten minste 75% overeenkomen met een eerder bepaalde 16S ribosomale RNA-gensequentie. Operationele taxonomische eenheid (OTU) clustering en analyse zal worden uitgevoerd met behulp van OTPicker. Clustering en hoofdcoördinatenanalyse zullen worden uitgevoerd met behulp van UniFrac. Aangezien fouten bij pyrosequencing optreden met een snelheid van slechts 0,25%, zullen de meeste van de 400-nucleotidesequenties die overblijven na filtering 0 of 1 fout bevatten. Dit niveau van sequentiefouten heeft geen invloed op de taxonomische analyse.

De uiteindelijke dataset voor microbiële taxonomische analyse van de dikke darm zal worden vergeleken met de 1.358.426-sequentie Ribosomal Database Project Release 10.

SEROTONINE TRANSPORTER POLYMORFISME Voor genotypering zal DNA worden geïsoleerd uit bloedplaatjes (uit veneus bloed) en colonbiopten door middel van standaard fenol/chloroform-extractie.

Het 44-bp insertie/deletie-polymorfisme in het promotorgebied (SERT-P) zal worden geanalyseerd door middel van PCR van monster-DNA met voorwaartse primer 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' en omgekeerde primer 5'-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3'. De verwachte productgroottes zijn respectievelijk 484 bp voor deletie (s) en 528 bp voor insertie (l).

Het 17-bp VNTR-polymorfisme van SERT-gen-intron 2 zal worden bestudeerd door middel van PCR van monster-DNA met voorwaartse primer 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' en omgekeerde primer 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. De verwachte productgroottes voor allelen 9, 10, 11 en 12 zijn respectievelijk 253bp, 270bp, 287bp en 304bp.

De SERT-eiwitexpressies in het colon en in de bloedplaatjes zullen ook bestudeerd worden door middel van real-time PCR en western blot-methode.