Manipulacja nadwrażliwością trzewną bakteriami probiotycznymi w zespole jelita drażliwego

Tło

Niepełne zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw zespołu jelita drażliwego (IBS) utrudnia opracowanie skutecznej terapii tego schorzenia. Jest to bardzo spóźnione w przypadku choroby, która dotyka co najmniej 20 procent populacji (1) i ma duży wpływ na jakość życia pacjentów (QOL) (2). Obecne zrozumienie etiologii i patogenezy IBS koncentruje się na dwa poziomy: oś mózg-jelito, która zapewnia pojęcie, w jaki sposób stres, emocje i warunki psychiczne zmieniają postrzeganie objawów IBS. W obrębie ściany jelita mechanizmy patofizjologiczne związane z IBS obejmują infekcję, aktywację immunologiczną, zaburzenia motoryki, nieprawidłową fermentację i nadwrażliwość trzewną. Badania wykazały, że progi bólu trzewnego w odpowiedzi na stres są niższe u pacjentów z IBS w porównaniu ze zdrowymi ochotnikami (3). Ta nadwrażliwość jest widoczna w odpowiedzi zarówno na bodziec fizyczny, jak i chemiczny, ale wyzwalacze nadwrażliwości trzewnej pozostają w dużej mierze nieznane. Bakterie jelitowe odgrywają znaczącą rolę w wywoływaniu IBS. Na przykład poinfekcyjny IBS rozwinął się w podgrupie pacjentów po ataku zapalenia żołądka i jelit (4). Manipulowanie mikroflorą komensalną może złagodzić objawy IBS i istnieją pewne dowody na to, że preparaty probiotyczne zawierające niektóre Bifidobacteria mogą być szczególnie skuteczne (5). Ta propozycja będzie koncentrować się na dalszym eksplorowaniu mechanizmów leżących u podstaw nadwrażliwości trzewnej na bezpośrednie ukierunkowanie przyszłej terapii preparatem probiotycznym.

Cele Celem tego badania jest (i) identyfikacja zmian mikroflory jelitowej związanych z IBS; (ii) zbadanie ekspresji i genotypowania SERT oraz ich związku z mikroflorą jelitową oraz (iii) określenie, czy terapia probiotykami zmienia wrażliwość trzewną u pacjentów z IBS i czy wywołane probiotykami zmiany w nadwrażliwości trzewnej są związane ze zmianami mikroflory jelitowej .

Hipoteza Badacze postulują, że bakterie modulują aferentną sygnalizację czuciową i sygnalizację serotoninową, niezbędną do czucia trzewnego, oraz że szlaki te mogą być ukierunkowane na terapię IBS przy użyciu bakterii probiotycznych.

PLAN BADAŃ Niniejsze opracowanie składa się z dwóch części. Pierwsza część będzie badaniem przekrojowym porównującym mikroflorę okrężnicy i ekspresję SERT u pacjentów z IBS i zdrowych osób z grupy kontrolnej. Druga część obejmie pilotażowe badanie otwarte w celu oceny wpływu doustnych bakterii probiotycznych na nadwrażliwość trzewną, ekspresję SERT i mikroflorę błony śluzowej u pacjentów z IBS.

Wizyta wyjściowa Dziesięć pacjentów z IBS zostanie zrekrutowanych z przychodni. Ciężkość choroby zostanie określona podczas rejestracji za pomocą zatwierdzonego kwestionariusza objawów IBS. Otrzymane zostaną rutynowe badania krwi, w tym pełna morfologia krwi, profil biochemiczny i białko C-reaktywne. Wrażliwość odbytu na nacisk i ból zostanie oceniona za pomocą urządzenia Barostat. Urządzenie Barostat było stosowane w wielu innych badaniach jako miara nadwrażliwości trzewnej. Sprzęt do obu testów jest obecnie używany w naszym laboratorium. Zostanie przeprowadzona podstawowa kolonoskopia i pobrane zostaną biopsje odbytu. Dziesięć osób kontrolnych poddanych przesiewowej kolonoskopii w kierunku polipów lub raka jelita grubego, u których następnie stwierdzono prawidłową kolonoskopię, zostanie włączonych do badania FGI-Bx, w którym ich próbki tkanek zostaną użyte w tym badaniu.

Próbki wyjściowe z IBS:

1 tkanka odbytnicy (utrwalona w formalinie do histologii) 2 tkanki odbytnicy (polimorfizm SERT) 3 tkanki odbytnicy (mikrobiota błony śluzowej) 5 ml krwi w probówce z EDTA (polimorfizm SERT)

Próbki z kontroli:

1 tkanka odbytnicy (utrwalona w formalinie do histologii) 2 tkanki odbytnicy (polimorfizm SERT) 3 tkanki odbytnicy (mikrobiota błony śluzowej) 5 ml krwi w probówce z EDTA (polimorfizm SERT)

Interwencja Pacjenci z IBS będą otrzymywać VSL#3 (450 miliardów liofilizowanych bakterii/saszetkę) dwa razy dziennie przez 4 tygodnie. VSL#3 został wybrany do zastosowania w tym badaniu, ponieważ (a) zawiera trzy różne szczepy Bifidobacteria (oprócz pałeczek kwasu mlekowego i paciorkowców) oraz ograniczone dowody na to, że Bifidobacteria są najskuteczniejszymi probiotykami w IBS (13). Schemat badania znajduje się w załączniku 1.

Tydzień 4 Ocena

Odpowiedź kliniczna na terapię probiotykami Oceny zostaną przeprowadzone na początku badania iw 28. dniu terapii. Trzy objawy IBS zostaną ocenione w celu określenia odpowiedzi na terapię: ból brzucha/dyskomfort, wzdęcia/rozdęcie i wypróżnienia, każdy oceniany w skali porządkowej (skala Likerta; maksymalny wynik 7) i w 100 mm wizualnej skali analogowej (VAS; maksymalny wynik 100). Dla każdego pacjenta zostanie również obliczony zbiorczy wynik z sumami 3 głównych objawów (maksymalny wynik w skali Likerta 21) (VAS; maksymalny wynik 300). Zostanie przeprowadzone ponowne badanie wrażliwości rektalnej.

Zmiany mikroflory błony śluzowej w odpowiedzi na terapię probiotykami Oceny zostaną przeprowadzone na początku badania iw dniu 28. Ze względu na nieco inwazyjny charakter powtórnej kolonoskopii, badacze wykonają elastyczną sigmoidoskopię tylko w celu uzyskania biopsji odbytnicy po leczeniu probiotykami.

Próbki z tygodnia 4 z IBS:

1. tkanka odbytu (utrwalona formaliną do histologii)
2. tkanki odbytnicy (polimorfizm SERT)
3. tkanki odbytnicy (mikrobiom błony śluzowej)

5ml krwi w EDTA (polimorfizm SERT)

Sześciomiesięczna obserwacja Po 6 miesiącach skontaktujemy się z pacjentami w celu ponownej oceny objawów w celu określenia długoterminowego wpływu terapii.

KOLONOSKOPIA Kolonoskopia zostanie przeprowadzona w trybie ambulatoryjnym w sedacji dożylnej diazepamem i petydyną. Pacjenci otrzymają preparat jelita z PEG. W przypadku elastycznej sigmoidoskopii należy wykonać badanie bez przygotowania i pobrać cztery biopsje w odległości 15 cm od brzegu odbytu.

BAROSTAT REKTALNY Barostat zawiera wbudowany system komputerowy, który można zaprogramować tak, aby automatycznie wykonywał rozprężanie balonika ze stałymi opóźnieniami czasowymi i przyrostami ciśnienia worka. Zmiana objętości balonu przy stałym ciśnieniu odzwierciedla zmianę napięcia i podatności ściany trzewnej. Ponadto, poprzez zaprogramowaną zmianę ciśnienia wewnątrz balonika, można ocenić próg sensoryczny pacjenta.

Pacjent jest poinstruowany, aby podać doodbytniczo 4,5 uncji fosforanów sodu na 4 godziny przed badaniem w domu w celu oczyszczenia odbytnicy. Po 3-godzinnym poście uczestnik zostanie ułożony w pozycji lewego boku. Worek z barostatem jest wprowadzany do odbytnicy. Urządzenie barostatu jest podłączone do cewnika barostatu za pomocą rurki PVC o niskiej podatności.

Po 10 minutach odpoczynku fazowe izobaryczne rozdęcie odbytnicy jest wykonywane automatycznie przy użyciu protokołu rosnącej metody limitów (AML) z kolejnymi przyrostami o 4 mm Hg (czas trwania 40 sekund) na przemian z przerywanymi okresami deflacji worka (40 sekund). Podczas każdej fazy wzdęcia uczestnik jest proszony o zgłaszanie ocen percepcji poprzez naciśnięcie panelu percepcji barostatu z następującą skalą: (1) Brak odczucia rozdęcia balonika, (2) pierwsze odczucie rozdęcia balonika, (3) pragnienie wypróżnienia, (4) maksymalne znośne odczucie. Procedura zostanie zatrzymana, gdy zostanie zgłoszony ból lub maksymalne tolerowane uczucie. Próg czuciowy definiuje się jako dolną granicę ciśnienia worka, która wywołuje pierwsze odczucie rozdęcia balonika. Próg bólu definiuje się jako nacisk, który wywołuje reakcję „bólową” lub maksymalne znośne odczucie.

MIKROBIOTA ŚLUZOWA Próbki okrężnicy zostaną pobrane w celu reprezentowania przylegającej flory bakteryjnej. Wszystkie próbki będą przechowywane w temperaturze -80 stopni Celsjusza do momentu użycia. Każda próbka zostanie dodana do probówek zawierających 500 µl fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:24:1) i 500 µl kulek cyrkonu/krzemionki o średnicy 0,1 mm (Biospec Products, Barthesville, OK). Komórki drobnoustrojów zostaną rozerwane mechanicznie w temperaturze 23 stopni Celsjusza za pomocą ubijaka do kulek (Biospec Products, instrument ustawiony na wysoką moc przez 2 minuty). Izolowane DNA będzie frakcjonowane przez elektroforezę w 1% żelach agarozowych, a dominujący prążek zostanie oczyszczony za pomocą zestawu MiniElute Gel Extraction Kit (Qiagen).

Amplifikacja sekwencji bakteryjnego rybosomalnego RNA 16S do pirosekwencjonowania zostanie przeprowadzona metodą PCR. Dla każdej próbki amplifikuje się 100-200 mg oczyszczonego genomowego DNA przy użyciu starterów BSR357-A i BSF8-B, które przyłączają się do konserwatywnych regionów bakteryjnego genu 16s rRNA. Produkty PCR zostaną zsekwencjonowane przy użyciu systemu 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX (dostarczonego przez Wydział Nauk CUHK). Kontrola jakości będzie prowadzona według następujących kryteriów: sekwencja powinna (i) wykazywać idealne dopasowanie do kodu kreskowego i startera genu 16S rybosomalnego RNA, (ii) mieć długość co najmniej 50 nukleotydów, (iii) mieć nie więcej niż dwa nieokreślone zasady w odczytanej sekwencji i (iv) mają co najmniej 75% dopasowania do wcześniej określonej sekwencji genu 16S rybosomalnego RNA. Grupowanie i analiza operacyjnych jednostek taksonomicznych (OTU) zostanie przeprowadzona przy użyciu OTUPicker. Grupowanie i analiza głównych współrzędnych zostanie przeprowadzona przy użyciu UniFrac. Ponieważ błędy w pirosekwencjonowaniu występują z szybkością zaledwie 0,25%, większość z 400-nukleotydowych sekwencji, które pozostają po filtrowaniu, będzie zawierała 0 lub 1 błąd. Ten poziom błędu sekwencjonowania nie wpłynie na analizę taksonomiczną.

Ostateczny zestaw danych do analizy taksonomicznej mikroorganizmów okrężnicy zostanie porównany z 1 358 426 sekwencjami Ribosomal Database Project Release 10.

POLIMORFIZM TRANSPORTERA SEROTONINY W celu genotypowania, DNA zostanie wyizolowane z płytek krwi (z krwi żylnej) i biopsji okrężnicy za pomocą standardowej ekstrakcji fenolem/chloroformem.

Polimorfizm insercji/delecji 44 pz w regionie promotora (SERT-P) będzie analizowany metodą PCR próbki DNA ze starterem do przodu 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' i starterem do tyłu 5'-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3'. Oczekiwane wielkości produktu wynoszą odpowiednio 484 bp dla delecji (s) i 528 bp dla insercji (1).

Polimorfizm VNTR 17 pz intronu 2 genu SERT będzie badany metodą PCR próbki DNA ze starterem przednim 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' i starterem wstecznym 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. Oczekiwana wielkość produktu dla alleli 9, 10, 11 i 12 wynosi odpowiednio 253 pz, 270 pz, 287 pz i 304 pz.

Ekspresja białek SERT w okrężnicy i płytkach krwi będzie również badana metodą PCR w czasie rzeczywistym i Western blot.