Viskeraalisen yliherkkyyden manipulointi probioottibakteerilla ärtyvän suolen oireyhtymässä

Tausta

Epätäydellinen ymmärrys ärtyvän suolen oireyhtymän (IBS) taustalla olevista mekanismeista on haitannut tehokkaan hoidon kehittämistä tähän sairauteen. Tämä on kauan myöhässä sairaudesta, joka vaikuttaa vähintään 20 prosenttiin väestöstä (1) ja jolla on suuri vaikutus potilaan elämänlaatuun (QOL) (2). Nykyinen ymmärrys IBS:n ​​taustalla olevasta etiologiasta ja patogeneesistä keskittyy kaksi tasoa: aivojen ja suoliston akseli, joka antaa käsityksen siitä, kuinka stressi, tunteet ja psyykkiset olosuhteet muuttavat käsitystä IBS-oireista. Suolen seinämän sisällä IBS:n ​​aiheuttamiin patofysiologisiin mekanismeihin kuuluvat infektio, immuuniaktivaatio, dysmotiliteetti, epänormaali fermentaatio ja sisäelinten yliherkkyys. Tutkimukset ovat osoittaneet, että viskeraaliset kipukynnykset vasteena stressiin ovat alhaisemmat IBS-potilailla verrattuna terveisiin vapaaehtoisiin (3). Tämä yliherkkyys on ilmeistä vasteena sekä fysikaaliselle että kemialliselle ärsykkeelle, mutta viskeraalisen yliherkkyyden laukaisevat tekijät ovat suurelta osin tuntemattomia. suoliston bakteereilla on merkittävä rooli IBS:n ​​indusoinnissa. Esimerkiksi infektion jälkeinen IBS kehittyi potilaiden alaryhmälle maha-suolitulehduksen seurauksena (4). Kommensaalimikrobiston manipulointi voi lievittää IBS-oireita, ja on näyttöä siitä, että tiettyjä bifidobakteereja sisältävät probioottivalmisteet voivat olla erityisen tehokkaita (5). Tämä ehdotus keskittyy sisäelinten yliherkkyyden taustalla olevien mekanismien lisätutkimukseen probioottivalmisteen hoidon ohjaamiseksi tulevaisuudessa.

Tavoitteet Tämän tutkimuksen tavoitteet ovat (i) tunnistaa IBS:ään liittyvät muutokset suoliston mikrobiotassa; (ii) tutkia SERT:n ilmentymistä ja genotyypitystä sekä niiden suhdetta suoliston mikrobiotaan ja (iii) määrittää, muuttaako probioottihoito sisäelinten herkkyyttä IBS-potilailla ja liittyvätkö probioottien aiheuttamat muutokset sisäelinten yliherkkyyteen muutoksiin suoliston mikrobiotassa .

Hypoteesi Tutkijat olettavat, että bakteerit moduloivat sensorista afferenttia signalointia ja serotoniinin signalointia, jotka ovat välttämättömiä sisäelinten tuntemukselle ja että nämä reitit voidaan kohdistaa IBS:n ​​hoitoon probioottisilla bakteereilla.

TUTKIMUSSUUNNITELMA Tämä tutkimus koostuu kahdesta osasta. Ensimmäinen osa on poikkileikkaustutkimus, jossa verrataan paksusuolen mikrobiota ja SERT-ilmentymistä IBS-potilailla ja terveillä kontrolleilla. Toinen osa sisältää avoimen pilottitutkimuksen, jossa arvioidaan suun probioottisten bakteerien vaikutuksia sisäelinten yliherkkyyteen, SERT-ilmentymiseen ja limakalvojen mikrobiotaan IBS-potilailla.

Peruskäynti Kymmenen IBS-potilasta rekrytoidaan poliklinikoista. Taudin vakavuus määritetään ilmoittautumisen yhteydessä validoidulla IBS-oirekyselylomakkeella. Rutiininomaiset verikokeet, mukaan lukien täydellinen verenkuva, biokemiallinen profiili ja C-reaktiivinen proteiini, otetaan. Peräsuolen herkkyys paineelle ja kivulle arvioidaan Barostat-laitteella. Barostat-laitetta on käytetty monissa muissa tutkimuksissa viskeraalisen yliherkkyyden mittana. Molempien testien laitteet ovat tällä hetkellä käytössä laboratoriossamme. Perustason kolonoskopia suoritetaan ja peräsuolen biopsiat otetaan. Kymmenen kontrollia, joille tehdään seulontakolonoskopia polyyppien tai paksusuolensyövän varalta ja joilla on sittemmin todettu normaali kolonoskopia, otetaan mukaan FGI-Bx-tutkimukseen, jossa heidän kudosnäytteitään käytettäisiin tässä tutkimuksessa.

Perusnäytteet IBS:stä:

1 peräsuolen kudos (formaliini kiinnitetty histologiaa varten) 2 peräsuolen kudosta (SERT-polymorfismi) 3 peräsuolen kudosta (limakalvon mikrobiota) 5 ml verta EDTA-putkessa (SERT-polymorfismi)

Näytteitä ohjaimista:

1 peräsuolen kudos (formaliini kiinnitetty histologiaa varten) 2 peräsuolen kudosta (SERT-polymorfismi) 3 peräsuolen kudosta (limakalvon mikrobiota) 5 ml verta EDTA-putkessa (SERT-polymorfismi)

Interventio IBS-potilaat saavat VSL#3:a (450 miljardia lyofilisoitua bakteeria/pussi) kahdesti päivässä 4 viikon ajan. VSL#3 valittiin käytettäväksi tässä tutkimuksessa, koska (a) se sisältää kolme erilaista Bifidobacteria-kantaa (laktobasillien ja streptokokkien lisäksi) ja saatavilla olevan rajallisen näytön perusteella Bifidobacteria on tehokkain probiootti IBS:ssä (13). Tutkimuksen vuokaavio on liitteessä 1.

Viikko 4 Arviointi

Kliininen vaste probioottihoidolle Arvioinnit tehdään lähtötilanteessa ja hoidon 28. päivänä. IBS:n ​​kolme oiretta arvioidaan hoitovasteen määrittämiseksi: vatsakipu/epämukavuus, turvotus/turvotus ja suolen liikkeet, jokainen pisteytetään järjestysasteikolla (Likert-asteikko; maksimipistemäärä 7) ja 100 mm:n visuaalisella analogisella asteikolla (VAS; maksimipisteet 100). Jokaiselle potilaalle lasketaan myös yhdistetty pistemäärä, jossa on kolmen pääoireen summat (Likert-asteikon maksimipistemäärä 21) (VAS; maksimipistemäärä 300). Toistuva peräsuolen herkkyystesti suoritetaan.

Muutokset limakalvon mikrobiotassa vasteena probioottihoidolle Arvioinnit tehdään lähtötilanteessa ja päivänä 28. Toistuvan kolonoskopian invasiivisen luonteen vuoksi tutkijat suorittavat vain joustavan sigmoidoskopian saadakseen peräsuolen biopsiat probioottihoidon jälkeen.

Viikon 4 näytteet IBS:stä:

1. peräsuolen kudos (histologiaa varten vahvistettu formaliini)
2. peräsuolen kudokset (SERT-polymorfismi)
3. peräsuolen kudokset (limakalvon mikrobiota)

5 ml verta EDTA:ssa (SERT-polymorfismi)

Kuuden kuukauden seuranta Potilaisiin otetaan yhteyttä kuuden kuukauden kuluttua oirepisteiden uudelleenarvioimiseksi hoidon pidemmän aikavälin vaikutuksen määrittämiseksi.

KOLONOSKOPIA Kolonoskopia suoritetaan avohoidossa tietoisen sedaation alaisena suonensisäisellä diatsepaamilla ja petidiinillä. Koehenkilöt saavat suolen valmistelua PEG:llä. Joustavaa sigmoidoskopiaa varten tehdään valmistelematon tutkimus ja otetaan neljä biopsiaa 15 cm:n etäisyydeltä peräaukon reunasta.

RECTAL BAROSTAT Barostat-laite sisältää sisäänrakennetun tietokonejärjestelmän, joka voidaan ohjelmoida automaattisesti suorittamaan ilmapallon venytykset kiinteällä aikaviiveellä ja pussin paineen lisäyksillä. Ilmapallon tilavuuden vaihtelu vakiopaineessa heijastaa sisäelinten seinämän sävyn muutosta ja mukautumista. Lisäksi ilmapallon sisäisen paineen ohjelmoidun vaihtelun avulla voidaan arvioida kohteen sensorinen kynnys.

Potilasta neuvotaan antamaan 4,5 fl unssia natriumfosfaattia rektaalisesti 4 tuntia ennen kotitutkimusta peräsuolen puhdistamiseksi. 3 tunnin paaston jälkeen osallistuja asetetaan vasemmalle sivuasentoon. Barostaattipussi asetetaan peräsuoleen. Barostaattilaite liitetään barostaattikatetriin käyttämällä alhaista yhteensopivuutta PVC-letkua.

10 minuutin levon jälkeen faasiset isobaariset peräsuolen venytykset suoritetaan automaattisesti käyttämällä nousevan menetelmän rajojen (AML) protokollaa 4 mm Hg:n peräkkäisillä lisäyksillä (40 sekunnin kesto) vuorotellen pussin jaksottaisten tyhjennysjaksojen kanssa (40 sekuntia). Jokaisen venytysvaiheen aikana osallistujaa pyydetään raportoimaan havaintoarvot painamalla barostaattilaitteen havaintopaneelia seuraavalla asteikolla: (1) Ei ilmapallon venymisen tunnetta, (2) ensimmäinen ilmapallon venymisen tunne, (3) halu ulostaa, (4) suurin siedettävä tunne. Toimenpide lopetetaan, kun kipua tai suurinta siedettävää tunnetta ilmoitetaan. Sensorinen kynnys määritellään pussin paineen alarajaksi, joka herättää ensimmäisen ilmapallon venymisen tunteen. Kipukynnys määritellään paineeksi, joka saa aikaan "kipuvasteen" tai suurimman siedettävän tunteen.

MUCOSAL MICROBIOTA Paksusuolinäytteet otetaan edustamaan kiinnittyvää bakteeriflooraa. Kaikki näytteet säilytetään -80 celsiusasteessa käyttöön asti. Jokainen näyte lisätään putkiin, jotka sisältävät 500 µl fenolia: Kloroformi: isoamyylialkoholi (24:24:1) ja 500 µl halkaisijaltaan 0,1 mm:n zirkoniumoksidi/piidioksidihelmiä (Biospec Products, Barthesville, OK). Mikrobisolut hajotetaan mekaanisesti 23 celsiusasteessa helmivatkaimella (Biospec Products, instrumentti asetettu korkealle 2 minuutiksi). Eristetty DNA fraktioidaan elektroforeesilla 1-prosenttisten agaroosigeelien läpi, ja hallitseva vyöhyke puhdistetaan MiniElute Gel Extraction -pakkauksella (Qiagen).

Bakteerien 16S ribosomaalisten RNA-sekvenssien monistus pyrosekvensointia varten suoritetaan PCR:llä. Jokaista näytettä kohden 100-200 mg puhdistettua genomista DNA:ta monistetaan käyttämällä alukkeita BSR357-A ja BSF8-B, jotka pariutuvat bakteerin 16s rRNA-geenin konservoituneisiin alueisiin. PCR-tuotteet sekvensoidaan käyttämällä 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX -järjestelmää (toimittaja Faculty of Science, CUHK). Laadunvalvonta saavutetaan seuraavilla kriteereillä: sekvenssin tulee (i) osoittaa täydellisesti yhteensopivuutta viivakoodin ja 16S ribosomaalisen RNA-geenin alukkeen kanssa, (ii) olla vähintään 50 nukleotidia pitkä, (iii) olla enintään kaksi määrittämättömät emäkset luetussa sekvenssissä, ja (iv) niillä on vähintään 75-prosenttinen yhteensopivuus aiemmin määritetyn 16S-ribosomaalisen RNA-geenisekvenssin kanssa. Operatiivisen taksonomisen yksikön (OTU) klusterointi ja analysointi toteutetaan OTUPickerin avulla. Klusterointi ja pääkoordinaattianalyysi suoritetaan UniFracilla. Koska pyrosekvensoinnin virheitä esiintyy vain 0,25 prosentin nopeudella, suurin osa 400 nukleotidin sekvensseistä, jotka jäävät jäljelle suodatuksen jälkeen, sisältää joko 0 tai 1 virheen. Tämä sekvensointivirhetaso ei vaikuta taksonomiseen analyysiin.

Lopullisia tietoja paksusuolen mikrobien taksonomista analyysiä varten verrataan 1 358 426 sekvenssin ribosomaalisen tietokantaprojektin julkaisuun 10.

SEROTONIN TRANSPORTER POLYMORFISMI Genotyypitystä varten DNA eristetään verihiutaleista (laskimoverestä) ja paksusuolen biopsioista tavallisella fenoli/kloroformiuutolla.

44 bp:n insertio/deleetiopolymorfismi promoottorialueella (SERT-P) analysoidaan PCR:llä näyte-DNA:sta eteenpäin alukkeella 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' ja käänteisellä alukkeella 5'-GGC GTT. GCC GCT CTG AAT GC-3'. Odotetut tuotekoot ovat 484 bp deleetiolle (s) ja 528 bp insertiolle (l).

SERT-geenin intronin 2 17 bp:n VNTR-polymorfismia tutkitaan näytteen DNA:n PCR:llä eteenpäinalukkeella 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' ja käänteisalukkeella 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. Odotetut tuotekoot alleeleille 9, 10, 11 ja 12 ovat 253 bp, 270 bp, 287 bp ja 304 bp.

Myös paksusuolen ja verihiutaleiden SERT-proteiinin ilmentymiä tutkitaan reaaliaikaisella PCR- ja Western blot -menetelmällä.