과민성 대장 증후군에서 생균제를 이용한 내장 과민증의 조절

배경

과민성 대장 증후군(IBS)의 기본 메커니즘에 대한 불완전한 이해는 이 상태에 대한 효과적인 치료법 개발을 방해했습니다. 이것은 인구의 최소 20%에 영향을 미치고(1) 환자의 삶의 질(QOL)에 큰 영향을 미치는 상태(2)에 대해 오랫동안 기한이 지났습니다. IBS의 근본적인 병인 및 병인에 대한 현재 이해는 두 가지 수준: 스트레스, 감정 및 심리적 조건이 모두 IBS 증상의 인식을 어떻게 바꾸는지에 대한 개념을 제공하는 뇌-장 축. 장 벽 내에서 IBS와 관련된 병리 생리학적 기전에는 감염, 면역 활성화, 운동 장애, 비정상적인 발효 및 내장 과민증이 포함됩니다. 연구에 따르면 스트레스에 대한 내장 통증 역치는 건강한 지원자에 비해 IBS 환자에서 더 낮습니다(3). 이 과민증은 물리적 및 화학적 자극 모두에 대한 반응으로 분명하지만 내장 과민증의 유발 요인은 거의 알려지지 않았습니다. 장내 세균은 IBS 유발에 중요한 역할을 합니다. 예를 들어 감염 후 IBS는 위장염을 앓은 환자의 하위 그룹에서 발생했습니다(4). 공생 미생물군의 조작은 IBS 증상을 완화할 수 있으며 특정 Bifidobacteria를 함유한 프로바이오틱 제제가 특히 효과적일 수 있다는 일부 증거가 있습니다(5). 이 제안은 장내 과민성의 기본 메커니즘에 대한 추가 탐색에 초점을 맞추어 미래의 프로바이오틱스 제제를 사용한 치료의 표적화를 지시할 것입니다.

목적 이 연구의 목적은 (i) 장내 미생물총에서 IBS 관련 변화를 확인하고; (ii) SERT 발현 및 유전자형, 장내 미생물군과의 관계 연구, (iii) 프로바이오틱스 요법이 IBS 환자의 내장 민감도를 변화시키는지 여부 및 프로바이오틱스 유도 내장 과민성 변화가 장내 미생물군 변화와 연관되는지 여부를 결정하기 위해 .

가설 연구자들은 박테리아가 내장 감각에 필요한 감각 구심성 신호 및 세로토닌 신호를 조절하고 이러한 경로가 프로바이오틱 박테리아를 사용하는 IBS 치료의 표적이 될 수 있다고 가정합니다.

연구 계획 이 연구는 두 부분으로 구성됩니다. 첫 번째 부분은 IBS 환자와 건강한 대조군에서 결장 미생물군과 SERT 발현을 비교하는 단면 연구입니다. 두 번째 부분은 IBS 환자의 내장 과민성, SERT 발현 및 점막 미생물군에서 경구 프로바이오틱 박테리아의 효과를 평가하기 위한 파일럿 공개 라벨 연구를 포함할 것입니다.

기준선 방문 IBS를 가진 10명의 피험자가 외래 진료소에서 모집될 것입니다. 질병 중증도는 검증된 IBS 증상 설문지로 등록 시 결정됩니다. 전체 혈구 수, 생화학 프로파일 및 C-반응성 단백질을 포함한 일상적인 혈액 검사를 받게 됩니다. 압력과 통증에 대한 직장 민감도는 Barostat 장치로 평가됩니다. Barostat 장치는 내장 과민성의 척도로 다른 많은 연구에서 사용되었습니다. 두 테스트용 장비는 현재 실험실에서 사용 중입니다. 기본 대장 내시경 검사가 수행되고 직장 생검이 수행됩니다. 폴립 또는 결장직장암에 대한 선별 대장내시경 검사를 받고 이후에 정상적인 대장내시경 검사를 받은 것으로 밝혀진 10개의 대조군이 FGI-Bx 연구에 참여하기 위해 포함될 것이며, 그들의 조직 샘플이 이 연구에서 사용될 것입니다.

IBS의 기본 샘플:

1 직장 조직(조직학을 위해 고정된 포르말린) 2 직장 조직(SERT 다형성) 3 직장 조직(점막 미생물군) EDTA 튜브의 혈액 5ml(SERT 다형성)

컨트롤의 샘플:

1 직장 조직(조직학을 위해 고정된 포르말린) 2 직장 조직(SERT 다형성) 3 직장 조직(점막 미생물군) EDTA 튜브의 혈액 5ml(SERT 다형성)

개입 IBS 환자는 VSL#3(4,500억 개의 동결건조 박테리아/포)를 4주 동안 매일 두 번 받게 됩니다. VSL#3은 (a) 3가지 다른 비피도박테리아 균주(락토바실러스 및 연쇄상구균 외에)를 포함하고 있으며 비피도박테리아가 IBS에서 가장 효과적인 프로바이오틱스라는 제한된 증거가 있기 때문에 이 연구에서 사용하기 위해 선택되었습니다(13) . 연구 흐름도는 부록 1에 있습니다.

4주 차 평가

프로바이오틱 치료에 대한 임상 반응 평가는 기준선 및 치료 28일에 이루어질 것이다. 치료에 대한 반응을 결정하기 위해 IBS의 3가지 증상을 평가합니다: 복통/불편감, 배부품/팽만감 및 배변, 각각 서수 척도(리커트 척도; 최대 점수 7) 및 100mm 시각적 아날로그 척도(VAS; 최대 점수 100). 각 환자에 대해 3가지 기본 증상의 합계를 포함하는 종합 점수도 계산됩니다(Likert 척도 최대 점수 21)(VAS; 최대 점수 300). 반복 직장 민감도 검사가 수행됩니다.

프로바이오틱 요법에 대한 반응으로 점막 미생물군의 변화 평가는 기준선 및 28일에 이루어질 것이다. 반복 대장 내시경 검사의 다소 침습적인 특성 때문에 조사관은 프로바이오틱스 치료 후 직장 생검을 얻기 위해 유연한 S상 결장경 검사만 수행할 것입니다.

IBS의 4주차 샘플:

1. 직장 조직(조직학을 위해 고정된 포르말린)
2. 직장 조직(SERT 다형성)
3. 직장 조직(점막 미생물총)

EDTA의 5ml 혈액(SERT 다형성)

6개월 추적 환자는 치료의 장기적인 영향을 결정하기 위해 증상 점수를 재평가하기 위해 6개월에 연락을 취할 것입니다.

COLONOSCOPY 결장경 검사는 디아제팜과 페티딘 정맥주사로 의식이 진정된 상태에서 외래 시술로 시행됩니다. 피험자는 PEG로 장 정결을 받게 됩니다. 굴곡성 S상 결장경 검사의 경우 준비되지 않은 검사를 수행하고 항문 가장자리에서 15cm에서 4개의 생검을 얻습니다.

직장 바로스타트 바로스타트 장치에는 고정된 시간 지연 및 백 압력 증분으로 풍선 팽창을 자동으로 수행하도록 프로그래밍할 수 있는 내장형 컴퓨터 시스템이 포함되어 있습니다. 일정한 압력에서 풍선 부피의 변화는 내장벽의 색조와 순응도의 변화를 반영합니다. 또한 풍선내 압력의 프로그래밍된 변화를 통해 피험자의 감각 역치를 평가할 수 있습니다.

환자는 직장 청소를 위해 집에서 공부하기 4시간 전에 4.5fl oz의 인산나트륨을 직장에 투여하도록 지시받습니다. 3시간 금식 후 참가자는 왼쪽 측면 위치에 배치됩니다. 바로스탯 백을 직장에 삽입합니다. 기압계 장치는 낮은 규정 준수 PVC 튜브를 사용하여 기압계 카테터에 연결됩니다.

10분의 휴식 후, 간헐적인 백 수축 기간(40초)과 번갈아 가며 4mmHg(40초 기간)의 연속적인 증분으로 AML(상승 한계 방법) 프로토콜을 사용하여 위상 등압 직장 확장을 자동으로 수행합니다. 각 팽창 단계에서 참가자는 다음 척도로 기압 장치의 지각 패널을 눌러 지각 등급을 보고하도록 요청받습니다: (1) 풍선 팽창 감각 없음, (2) 풍선 팽창의 첫 번째 감각, (3) 배변 욕구, (4) 최대 허용 감각. 통증이나 견딜 수 있는 최대 감각이 보고되면 절차가 중단됩니다. 감각 역치는 풍선 팽창의 첫 번째 감각을 불러일으키는 백 압력의 하한으로 정의됩니다. 통증 역치는 "통증" 반응 또는 최대 허용 감각을 유발하는 압력으로 정의됩니다.

MUCOSAL MICROBIOTA 결장 샘플을 채취하여 부착성 세균총을 나타냅니다. 모든 샘플은 사용 전까지 -80도에서 보관됩니다. 각 시료는 500µl의 페놀: 클로로포름: 이소아밀 알코올(24:24:1)과 500µl의 직경 0.1mm 지르코니아/실리카 비드(Biospec Products, Barthesville, OK)가 들어 있는 튜브에 추가됩니다. 미생물 세포는 비드 비터(Biospec Products, 2분 동안 높게 설정된 기기)를 사용하여 섭씨 23도에서 기계적으로 파괴됩니다. 분리된 DNA는 1% agarose gel을 통한 전기영동으로 분획하고, MiniElute Gel Extraction kit(Qiagen)로 지배적인 band를 정제합니다.

파이로시퀀싱을 위한 세균 16S 리보솜 RNA 서열의 증폭은 PCR에 의해 수행될 것이다. 각 샘플에 대해 100-200mg의 정제된 게놈 DNA가 박테리아 16s rRNA 유전자의 보존된 영역에 어닐링하는 프라이머 BSR357-A 및 BSF8-B를 사용하여 증폭됩니다. PCR 제품은 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX 시스템(CUHK 과학부 제공)을 사용하여 시퀀싱됩니다. 품질 관리는 다음 기준에 따라 달성됩니다. 시퀀스는 (i) 바코드 및 16S 리보솜 RNA 유전자 프라이머와 완벽하게 일치해야 하고, (ii) 길이가 최소 50개 뉴클레오티드이어야 하며, (iii) 2개 이하의 염기 서열이어야 합니다. 서열 판독에서 결정되지 않은 염기, 및 (iv) 이전에 결정된 16S 리보솜 RNA 유전자 서열과 적어도 75% 일치함. 운영 분류 단위(OTU) 클러스터링 및 분석은 OTUPicker를 사용하여 수행됩니다. 클러스터링 및 주요 좌표 분석은 UniFrac을 사용하여 수행됩니다. 파이로시퀀싱의 오류는 0.25%의 비율로 발생하기 때문에 필터링 후 남아 있는 400개 뉴클레오티드 시퀀스의 대부분은 0 또는 1 오류를 포함합니다. 이 수준의 시퀀싱 오류는 분류학적 분석에 영향을 미치지 않습니다.

결장 미생물 분류학 분석을 위한 최종 데이터 세트는 1,358,426개 서열의 Ribosomal Database Project Release 10과 비교됩니다.

세로토닌 운반체 다형성 유전자형 분석을 위해 DNA는 표준 페놀/클로로포름 추출에 의해 혈소판(정맥혈에서) 및 결장 생검에서 분리됩니다.

프로모터 영역(SERT-P)의 44-bp 삽입/결실 다형성은 정방향 프라이머 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' 및 역방향 프라이머 5'-GGC GTT를 사용한 샘플 DNA의 PCR에 의해 분석됩니다. GCC GCT CTG AAT GC-3'. 예상되는 제품 크기는 각각 삭제(s)의 경우 484bp, 삽입(l)의 경우 528bp입니다.

SERT 유전자 인트론 2의 17-bp VNTR 다형성은 정방향 프라이머 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' 및 역방향 프라이머 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3을 사용한 샘플 DNA의 PCR에 의해 연구될 것입니다. '. 대립유전자 9, 10, 11 및 12의 예상 생성물 크기는 각각 253bp, 270bp, 287bp 및 304bp입니다.

결장 및 혈소판 SERT 단백질 발현도 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯 방법으로 연구할 것입니다.