Manipulação da hipersensibilidade visceral com bactérias probióticas na síndrome do intestino irritável

Fundo

Uma compreensão incompleta dos mecanismos subjacentes à síndrome do intestino irritável (IBS) dificultou o desenvolvimento de uma terapia eficaz para esta condição. Isso é muito esperado para uma condição que afeta pelo menos 20 por cento da população (1) e tem um grande impacto na qualidade de vida do paciente (QOL) (2). A compreensão atual da etiologia subjacente e patogênese da SII está centrada em dois níveis: o eixo cérebro-intestino que fornece o conceito de como o estresse, a emoção e as condições psicológicas alteram a percepção dos sintomas da SII. Dentro da parede intestinal, os mecanismos fisiopatológicos implicados na SII incluem infecção, ativação imune, dismotilidade, fermentação anormal e hipersensibilidade visceral. Estudos demonstraram que os limiares de dor visceral em resposta ao estresse são mais baixos em pacientes com SII em comparação com voluntários saudáveis ​​(3). Essa hipersensibilidade é aparente em resposta a um estímulo físico e químico, mas os gatilhos da hipersensibilidade visceral permanecem amplamente desconhecidos. as bactérias intestinais desempenham um papel significativo na indução da SII. Por exemplo, a SII pós-infecciosa se desenvolveu em um subgrupo de pacientes após um surto de gastroenterite (4). A manipulação da microbiota comensal pode aliviar os sintomas da SII e há algumas evidências de que preparações probióticas contendo certas bifidobactérias podem ser particularmente eficazes (5). Esta proposta se concentrará em uma exploração mais aprofundada dos mecanismos subjacentes à hipersensibilidade visceral para direcionar o futuro direcionamento da terapia com preparação probiótica.

Objetivos Os objetivos deste estudo são (i) identificar alterações associadas à SII na microbiota intestinal; (ii) estudar a expressão e genotipagem de SERT e sua relação com a microbiota intestinal, e (iii) determinar se a terapia probiótica altera a sensibilidade visceral em pacientes com SII e se as alterações induzidas por probióticos na hipersensibilidade visceral estão associadas a alterações na microbiota intestinal .

Hipótese Os investigadores postulam que as bactérias modulam a sinalização aferente sensorial e a sinalização de serotonina, necessárias para a sensação visceral e que essas vias podem ser direcionadas para a terapia da SII usando bactérias probióticas.

PLANO DE PESQUISA Este estudo é composto por duas partes. A primeira parte será um estudo transversal comparando a microbiota colônica e a expressão de SERT em pacientes com SII e controles saudáveis. A segunda parte envolverá um estudo piloto aberto para avaliar os efeitos de bactérias probióticas orais na hipersensibilidade visceral, expressão de SERT e microbiota mucosa em pacientes com SII.

Visita inicial Dez indivíduos com IBS serão recrutados em clínicas ambulatoriais. A gravidade da doença será determinada na inscrição com um questionário de sintomas de SII validado. Exames de sangue de rotina, incluindo hemograma completo, perfil bioquímico e proteína C-reativa serão obtidos. A sensibilidade retal à pressão e à dor será avaliada com o dispositivo Barostat. O dispositivo barostato foi usado em muitos outros estudos como medida de hipersensibilidade visceral. O equipamento para ambos os testes está atualmente em uso em nosso laboratório. Uma colonoscopia inicial será realizada e biópsias retais serão feitas. Dez controles submetidos à colonoscopia de triagem para pólipos ou câncer colorretal e subsequentemente considerados com colonoscopia normal serão incluídos para participar do estudo FGI-Bx, no qual suas amostras de tecido seriam usadas neste estudo.

Amostras de linha de base de IBS:

1 tecido retal (fixado em formalina para histologia) 2 tecidos retais (polimorfismo SERT) 3 tecidos retais (microbiota da mucosa) 5ml de sangue em tubo EDTA (polimorfismo SERT)

Amostras de controles:

1 tecido retal (fixado em formalina para histologia) 2 tecidos retais (polimorfismo SERT) 3 tecidos retais (microbiota da mucosa) 5ml de sangue em tubo EDTA (polimorfismo SERT)

Os pacientes com SII de intervenção receberão VSL#3 (450 bilhões de bactérias liofilizadas/sachê) duas vezes ao dia durante 4 semanas. O VSL#3 foi selecionado para uso neste estudo porque (a) contém três cepas diferentes de Bifidobacteria (além de lactobacilos e estreptococos) e as evidências limitadas disponíveis de Bifidobacteria como os probióticos mais eficazes na SII (13). Um fluxograma do estudo está no apêndice 1.

Avaliação da Semana 4

A resposta clínica à terapia probiótica As avaliações serão feitas no início e no dia 28 da terapia. Os três sintomas da SII serão avaliados para determinar a resposta à terapia: dor/desconforto abdominal, inchaço/distensão e movimentos intestinais, cada um pontuado em uma escala ordinal (escala Likert; pontuação máxima 7) e em uma escala analógica visual de 100 mm (VAS; pontuação máxima 100). Uma pontuação composta com as somas dos 3 sintomas cardinais também será calculada para cada paciente (escala Likert pontuação máxima 21) (VAS; pontuação máxima 300). Repetir o teste de sensibilidade retal será realizado.

Alterações na microbiota da mucosa em resposta à terapia probiótica As avaliações serão feitas no início e no dia 28. Devido à natureza um tanto invasiva de uma colonoscopia repetida, os investigadores realizarão apenas uma sigmoidoscopia flexível para obter biópsias retais após o tratamento com probióticos.

Amostras da semana 4 da IBS:

1. tecido retal (formalina fixada para histologia)
2. tecidos retais (polimorfismo SERT)
3. tecidos retais (microbiota mucosa)

5ml de sangue em EDTA (polimorfismo SERT)

Acompanhamento de seis meses Os pacientes serão contatados em 6 meses para reavaliar os escores de sintomas para determinar o impacto da terapia a longo prazo.

COLONOSCOPIA A colonoscopia será realizada como um procedimento ambulatorial sob sedação consciente com diazepam intravenoso e petidina. Os indivíduos receberão preparo intestinal com PEG. Para a sigmoidoscopia flexível, será realizado um exame sem preparo e serão obtidas quatro biópsias a 15cm da borda anal.

BAROSTATO RETAL O dispositivo barostato contém um sistema de computador embutido que pode ser programado para realizar automaticamente distensões de balão com intervalos de tempo fixos e incrementos de pressão da bolsa. A variação no volume do balão em uma pressão constante reflete a mudança no tônus ​​e na complacência da parede visceral. Além disso, por meio de uma variação programada na pressão intrabalão, pode-se avaliar o limiar sensorial do sujeito.

O paciente é instruído a administrar 4,5 fl oz de fosfato de sódio por via retal 4 horas antes do estudo em casa para limpeza retal. Após jejum de 3 horas, o participante será posicionado em decúbito lateral esquerdo. Uma bolsa de barostato é inserida no reto. O dispositivo barostato é conectado ao cateter barostato usando um tubo de PVC de baixa complacência.

Após 10 minutos de repouso, distensões retais isobáricas fásicas são realizadas automaticamente usando o protocolo do método ascendente de limites (AML) com incrementos sucessivos de 4 mm Hg (duração de 40 segundos) alternados com períodos intermitentes de desinsuflação da bolsa (40 segundos). Durante cada fase de distensão, o participante é solicitado a relatar as classificações de percepção pressionando no painel de percepção do dispositivo barostato com a seguinte escala: (1) Nenhuma sensação de distensão do balão, (2) a primeira sensação de distensão do balão, (3) desejo de defecar, (4) sensação tolerável máxima. O procedimento será interrompido quando for relatada dor ou sensação tolerável máxima. O limiar sensorial é definido como o limite inferior da pressão da bolsa que evoca a primeira sensação de distensão do balão. O limiar da dor é definido como a pressão que provoca uma resposta de "dor" ou sensação tolerável máxima.

MICROBIOTA DA MUCOSA Amostras colônicas serão coletadas para representar a flora bacteriana aderente. Todas as amostras serão armazenadas a -80 graus Celsius até o uso. Cada amostra será adicionada a tubos contendo 500µl de fenol: clorofórmio:álcool isoamílico (24:24:1), e 500µl de esferas de zircônia/sílica de 0,1mm de diâmetro (Biospec Products, Barthesville, OK). As células microbianas serão rompidas mecanicamente a 23 graus Celsius com um batedor de esferas (Biospec Products, instrumento ajustado para alta por 2 minutos). O DNA isolado será fracionado por eletroforese através de géis de agarose 1%, e a banda dominante será purificada pelo kit MiniElute Gel Extraction (Qiagen).

A amplificação das sequências de RNA ribossômico 16S bacteriano para pirosequenciamento será realizada por PCR. Para cada amostra, 100-200mg de DNA genômico purificado serão amplificados usando os primers BSR357-A e BSF8-B, que se ligam a regiões conservadas do gene 16s rRNA bacteriano. Os produtos de PCR serão sequenciados usando o sistema 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX (fornecido pela Faculdade de Ciências, CUHK). O controle de qualidade será obtido pelos seguintes critérios: a sequência deve (i) mostrar uma correspondência perfeita com o código de barras e o primer do gene do RNA ribossômico 16S, (ii) ter pelo menos 50 nucleotídeos de comprimento, (iii) não ter mais de dois bases indeterminadas na sequência lida e (iv) têm pelo menos 75% de correspondência com uma sequência do gene de RNA ribossômico 16S previamente determinada. O agrupamento e a análise da unidade taxonômica operacional (OTU) serão realizados usando o OTUPicker. A análise de agrupamento e coordenada principal será realizada usando o UniFrac. Como os erros no pirosequenciamento ocorrem a uma taxa de apenas 0,25%, a maioria das sequências de 400 nucleotídeos que permanecem após a filtragem conterá 0 ou 1 erro. Este nível de erro de sequenciamento não afetará a análise taxonômica.

O conjunto de dados final para análise taxonômica microbiana colônica será comparado com o Projeto de Banco de Dados Ribossomal de 1.358.426 sequências Release 10.

POLIMORFISMO DO TRANSPORTADOR DE SEROTONINA Para genotipagem, o DNA será isolado de plaquetas sanguíneas (de sangue venoso) e biópsias de cólon por extração padrão de fenol/clorofórmio.

O polimorfismo de inserção/deleção de 44 pb na região promotora (SERT-P) será analisado por PCR de amostra de DNA com primer direto 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' e primer reverso 5'-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3'. Os tamanhos de produto esperados são 484 pb para deleção (s) e 528 pb para inserção (l), respectivamente.

O polimorfismo VNTR de 17 pb do íntron 2 do gene SERT será estudado por PCR de amostra de DNA com primer direto 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' e primer reverso 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. Os tamanhos de produtos esperados para os alelos 9, 10, 11 e 12 são 253bp, 270bp, 287bp e 304bp, respectivamente.

As expressões das proteínas SERT colônicas e plaquetárias também serão estudadas por PCR em tempo real e método de western blot.