Manipulación de la hipersensibilidad visceral con bacterias probióticas en el síndrome del intestino irritable

Fondo

Una comprensión incompleta de los mecanismos que subyacen al síndrome del intestino irritable (SII) ha obstaculizado el desarrollo de una terapia eficaz para esta afección. Esto es necesario desde hace mucho tiempo para una afección que afecta al menos al 20 por ciento de la población (1) y tiene un gran impacto en la calidad de vida (QOL) del paciente (2). La comprensión actual de la etiología subyacente y la patogenia del SII se centra en dos niveles: el eje cerebro-intestino que proporciona el concepto de cómo el estrés, la emoción y las condiciones psicológicas alteran la percepción de los síntomas del SII. Dentro de la pared intestinal, los mecanismos fisiopatológicos implicados en el SII incluyen infección, activación inmunitaria, alteración de la motilidad, fermentación anormal e hipersensibilidad visceral. Los estudios han demostrado que los umbrales de dolor visceral en respuesta al estrés son más bajos en pacientes con SII en comparación con voluntarios sanos (3). Esta hipersensibilidad es evidente en respuesta a un estímulo físico y químico, pero los desencadenantes de la hipersensibilidad visceral siguen siendo en gran parte desconocidos. las bacterias intestinales juegan un papel importante en la inducción del SII. Por ejemplo, el SII posinfeccioso se desarrolló en un subgrupo de pacientes después de un episodio de gastroenteritis (4). La manipulación de la microbiota comensal puede aliviar los síntomas del SII y existe cierta evidencia de que las preparaciones probióticas que contienen ciertas bifidobacterias pueden ser particularmente efectivas (5). Esta propuesta se centrará en una mayor exploración de los mecanismos subyacentes a la hipersensibilidad visceral para dirigir el futuro tratamiento con preparación de probióticos.

Objetivos Los objetivos de este estudio son (i) identificar los cambios asociados con el SII en la microbiota intestinal; (ii) estudiar la expresión y el genotipado de SERT, y su relación con la microbiota intestinal, y (iii) determinar si la terapia con probióticos altera la sensibilidad visceral en pacientes con SII y si los cambios en la hipersensibilidad visceral inducidos por probióticos están asociados con cambios en la microbiota intestinal .

Hipótesis Los investigadores postulan que las bacterias modulan la señalización aferente sensorial y la señalización de serotonina, necesarias para la sensación visceral y que estas vías pueden ser el objetivo de la terapia del SII utilizando bacterias probióticas.

PLAN DE INVESTIGACIÓN Este estudio consta de dos partes. La primera parte será un estudio transversal que compare la microbiota colónica y la expresión de SERT en pacientes con SII y controles sanos. La segunda parte incluirá un estudio piloto abierto para evaluar los efectos de las bacterias probióticas orales en la hipersensibilidad visceral, la expresión de SERT y la microbiota de la mucosa en pacientes con SII.

Visita de referencia Diez sujetos con SII serán reclutados de clínicas ambulatorias. La gravedad de la enfermedad se determinará en el momento de la inscripción con un cuestionario de síntomas del SII validado. Se obtendrán análisis de sangre de rutina que incluyen hemograma completo, perfil bioquímico y proteína C reactiva. La sensibilidad rectal a la presión y el dolor se evaluará con el dispositivo Barostat. El dispositivo barostat se ha utilizado en muchos otros estudios como medida de la hipersensibilidad visceral. El equipo para ambas pruebas está actualmente en uso en nuestro laboratorio. Se realizará una colonoscopia de referencia y se tomarán biopsias rectales. Diez controles que se sometieron a una colonoscopia de detección de pólipos o cáncer colorrectal y posteriormente se descubrió que tenían una colonoscopia normal se incluirán para participar en el estudio FGI-Bx, en el que sus muestras de tejido se usarán en este estudio.

Muestras de referencia de IBS:

1 tejido rectal (fijado en formalina para histología) 2 tejidos rectales (polimorfismo SERT) 3 tejidos rectales (microbiota mucosa) 5ml de sangre en tubo EDTA (polimorfismo SERT)

Muestras de controles:

1 tejido rectal (fijado en formalina para histología) 2 tejidos rectales (polimorfismo SERT) 3 tejidos rectales (microbiota mucosa) 5ml de sangre en tubo EDTA (polimorfismo SERT)

Intervención Los pacientes con SII recibirán VSL#3 (450 mil millones de bacterias liofilizadas/sobre) dos veces al día durante 4 semanas. Se seleccionó VSL#3 para su uso en este estudio porque (a) contiene tres cepas de bifidobacterias diferentes (además de lactobacilos y estreptococos) y la limitada evidencia disponible de bifidobacterias como los probióticos más efectivos en el SII (13). Un diagrama de flujo del estudio se encuentra en el apéndice 1.

Evaluación de la semana 4

Respuesta clínica a la terapia con probióticos Las evaluaciones se realizarán al inicio y en el día 28 de la terapia. Se evaluarán los tres síntomas del SII para determinar la respuesta a la terapia: dolor/malestar abdominal, hinchazón/distensión y evacuaciones intestinales, cada uno de ellos puntuado en una escala ordinal (escala de Likert; puntuación máxima de 7) y en una escala analógica visual de 100 mm (VAS; puntuación máxima 100). También se calculará una puntuación compuesta con las sumas de los 3 síntomas cardinales para cada paciente (puntuación máxima de la escala de Likert 21) (EVA; puntuación máxima 300). Se repetirán las pruebas de sensibilidad rectal.

Cambios en la microbiota de la mucosa en respuesta a la terapia con probióticos Las evaluaciones se realizarán al inicio y al día 28. Debido a la naturaleza algo invasiva de una colonoscopia repetida, los investigadores solo realizarán una sigmoidoscopia flexible para obtener biopsias rectales después del tratamiento con probióticos.

Muestras de la semana 4 de IBS:

1. tejido rectal (formalina fijada para histología)
2. tejidos rectales (polimorfismo SERT)
3. tejidos rectales (microbiota mucosa)

5 ml de sangre en EDTA (polimorfismo SERT)

Seis meses de seguimiento Se contactará a los pacientes a los 6 meses para reevaluar las puntuaciones de los síntomas para determinar el impacto a largo plazo de la terapia.

COLONOSCOPIA La colonoscopia se realizará como un procedimiento ambulatorio bajo sedación consciente con diazepam y petidina por vía intravenosa. Los sujetos recibirán preparación intestinal con PEG. Para la sigmoidoscopia flexible, se realizará un examen no preparado y se obtendrán cuatro biopsias a 15 cm del borde anal.

BAROSTATO RECTAL El dispositivo de barostato contiene un sistema informático integrado que se puede programar para realizar automáticamente distensiones del globo con retrasos de tiempo fijos e incrementos de presión de la bolsa. La variación en el volumen del globo a una presión constante refleja el cambio en el tono y la distensibilidad de la pared visceral. Además, mediante una variación programada de la presión intrabalón, se puede evaluar el umbral sensorial del sujeto.

Se indica al paciente que administre 4,5 onzas líquidas de fosfato de sodio por vía rectal 4 horas antes del estudio en el hogar para la limpieza rectal. Después de un ayuno de 3 horas, el participante se colocará en posición lateral izquierda. Se inserta una bolsa de barostato en el recto. El dispositivo de barostato se conecta al catéter de barostato utilizando un tubo de PVC de bajo cumplimiento.

Después de 10 minutos de reposo, las distensiones rectales isobáricas fásicas se realizan automáticamente utilizando el protocolo del método ascendente de límites (AML) con incrementos sucesivos de 4 mm Hg (40 segundos de duración) alternando con períodos intermitentes de desinflado de la bolsa (40 segundos). Durante cada fase de distensión, se solicita al participante que informe las calificaciones de percepción presionando el panel de percepción del dispositivo barostato con la siguiente escala: (1) Sin sensación de distensión del globo, (2) la primera sensación de distensión del globo, (3) deseo de defecar, (4) máxima sensación tolerable. El procedimiento se detendrá cuando se informe dolor o máxima sensación tolerable. El umbral sensorial se define como el límite inferior de la presión de la bolsa que provoca la primera sensación de distensión del balón. El umbral del dolor se define como la presión que provoca una respuesta de "dolor" o una sensación máxima tolerable.

MICROBIOTA MUCOSA Se tomarán muestras colónicas para representar la flora bacteriana adherente. Todas las muestras se almacenarán a -80 grados Celsius hasta su uso. Cada muestra se agregará a tubos que contengan 500 µl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (24:24:1) y 500 µl de perlas de zirconio/sílice de 0,1 mm de diámetro (Biospec Products, Barthesville, OK). Las células microbianas se romperán mecánicamente a 23 grados centígrados con un batidor de perlas (Biospec Products, instrumento configurado en alto durante 2 minutos). El ADN aislado se fraccionará mediante electroforesis a través de geles de agarosa al 1% y la banda dominante se purificará mediante el kit MiniElute Gel Extraction (Qiagen).

La amplificación de las secuencias de ARN ribosómico 16S bacteriano para la pirosecuenciación se realizará mediante PCR. Para cada muestra, se amplificarán entre 100 y 200 mg de ADN genómico purificado mediante el uso de cebadores BSR357-A y BSF8-B, que se hibridan con regiones conservadas del gen 16s rRNA bacteriano. Los productos de PCR se secuenciarán utilizando el sistema 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX (proporcionado por la Facultad de Ciencias, CUHK). El control de calidad se logrará mediante los siguientes criterios: la secuencia debe (i) mostrar una coincidencia perfecta con el código de barras y el cebador del gen del ARN ribosomal 16S, (ii) tener al menos 50 nucleótidos de longitud, (iii) no tener más de dos bases indeterminadas en la secuencia leída, y (iv) tienen al menos un 75 % de coincidencia con una secuencia del gen de ARN ribosomal 16S previamente determinada. La agrupación y el análisis de unidades taxonómicas operativas (OTU) se llevarán a cabo utilizando OTUPicker. El agrupamiento y el análisis de coordenadas principales se llevarán a cabo utilizando UniFrac. Dado que los errores en la pirosecuenciación se producen a una tasa de solo el 0,25 %, la mayoría de las secuencias de 400 nucleótidos que quedan después del filtrado contendrán 0 o 1 error. Este nivel de error de secuenciación no afectará el análisis taxonómico.

El conjunto de datos final para el análisis taxonómico microbiano del colon se comparará con la versión 10 del proyecto de base de datos ribosomal de 1 358 426 secuencias.

POLIMORFISMO DEL TRANSPORTADOR DE SEROTONINA Para la determinación del genotipo, se aislará el ADN de las plaquetas sanguíneas (de sangre venosa) y de biopsias de colon mediante extracción estándar con fenol/cloroformo.

El polimorfismo de inserción/deleción de 44 pb en la región promotora (SERT-P) se analizará mediante PCR del ADN de la muestra con el cebador directo 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' y el cebador inverso 5'-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3'. Los tamaños de producto esperados son 484 pb para la deleción (s) y 528 pb para la inserción (l) respectivamente.

El polimorfismo VNTR de 17 pb del intrón 2 del gen SERT se estudiará mediante PCR del ADN de la muestra con el cebador directo 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' y el cebador inverso 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. Los tamaños de producto esperados para los alelos 9, 10, 11 y 12 son 253 pb, 270 pb, 287 pb y 304 pb, respectivamente.

Las expresiones de la proteína SERT colónica y plaquetaria también se estudiarán mediante PCR en tiempo real y el método de transferencia Western.