Manipulation de l'hypersensibilité viscérale avec des bactéries probiotiques dans le syndrome du côlon irritable

Arrière plan

Une compréhension incomplète des mécanismes sous-jacents au syndrome du côlon irritable (IBS) a entravé le développement d'une thérapie efficace pour cette condition. Ceci est attendu depuis longtemps pour une condition qui affecte au moins 20 % de la population (1) et a un impact majeur sur la qualité de vie (QOL) du patient (2). La compréhension actuelle de l'étiologie et de la pathogenèse sous-jacentes du SCI est centrée sur deux niveaux : l'axe cerveau-intestin qui fournit un concept de la façon dont le stress, l'émotion et les conditions psychologiques modifient la perception des symptômes du SII. Au sein de la paroi intestinale, les mécanismes physiopathologiques impliqués dans le SCI comprennent l'infection, l'activation immunitaire, la dysmotilité, la fermentation anormale et l'hypersensibilité viscérale. Des études ont montré que les seuils de douleur viscérale en réponse au stress sont inférieurs chez les patients atteints du SCI par rapport aux volontaires sains (3). Cette hypersensibilité est apparente en réponse à la fois à un stimulus physique et chimique, mais les déclencheurs de l'hypersensibilité viscérale restent largement inconnus. les bactéries intestinales jouent un rôle important dans l'induction du SCI. Par exemple, le SII post-infectieux s'est développé dans un sous-groupe de patients à la suite d'un épisode de gastro-entérite (4). La manipulation du microbiote commensal peut atténuer les symptômes du SCI et il existe certaines preuves que les préparations probiotiques contenant certaines bifidobactéries peuvent être particulièrement efficaces (5). Cette proposition se concentrera sur une exploration plus approfondie des mécanismes sous-jacents à l'hypersensibilité viscérale pour orienter le futur ciblage de la thérapie avec une préparation probiotique.

Objectifs Les objectifs de cette étude sont (i) d'identifier les changements associés à l'IBS dans le microbiote intestinal ; (ii) étudier l'expression et le génotypage des SERT, et leur relation avec le microbiote intestinal, et (iii) déterminer si la thérapie probiotique modifie la sensibilité viscérale chez les patients atteints du SCI et si les modifications induites par les probiotiques dans l'hypersensibilité viscérale sont associées à des modifications du microbiote intestinal .

Hypothèse Les chercheurs postulent que les bactéries modulent la signalisation sensorielle afférente et la signalisation de la sérotonine, nécessaires à la sensation viscérale et que ces voies peuvent être ciblées pour le traitement du SCI à l'aide de bactéries probiotiques.

PLAN DE RECHERCHE Cette étude comprend deux parties. La première partie sera une étude transversale comparant le microbiote colique et l'expression de SERT chez des patients atteints du SCI et des témoins sains. La deuxième partie impliquera une étude pilote en ouvert pour évaluer les effets des bactéries probiotiques orales sur l'hypersensibilité viscérale, l'expression des SERT et le microbiote muqueux chez les patients atteints du SCI.

Visite de base Dix sujets atteints du SCI seront recrutés dans des cliniques externes. La gravité de la maladie sera déterminée lors de l'inscription à l'aide d'un questionnaire validé sur les symptômes du SCI. Des tests sanguins de routine, y compris une numération globulaire complète, un profil biochimique et une protéine C-réactive, seront obtenus. La sensibilité rectale à la pression et à la douleur sera évaluée avec le dispositif Barostat. Le dispositif barostat a été utilisé dans de nombreuses autres études comme mesure de l'hypersensibilité viscérale. L'équipement pour les deux tests est actuellement utilisé dans notre laboratoire. Une coloscopie de base sera effectuée et des biopsies rectales seront prises. Dix témoins subissant une coloscopie de dépistage des polypes ou du cancer colorectal et ayant par la suite une coloscopie normale seront inclus pour participer à l'étude FGI-Bx, dans laquelle leurs échantillons de tissus seront utilisés dans cette étude.

Échantillons de base de l'IBS :

1 tissu rectal (formol fixé pour l'histologie) 2 tissus rectaux (polymorphisme SERT) 3 tissus rectaux (microbiote muqueux) 5 ml de sang en tube EDTA (polymorphisme SERT)

Échantillons de témoins :

1 tissu rectal (formol fixé pour l'histologie) 2 tissus rectaux (polymorphisme SERT) 3 tissus rectaux (microbiote muqueux) 5 ml de sang en tube EDTA (polymorphisme SERT)

Intervention Les patients SII recevront du VSL#3 (450 milliards de bactéries lyophilisées/sachet) deux fois par jour pendant 4 semaines. VSL # 3 a été sélectionné pour être utilisé dans cette étude parce que (a) il contient trois souches différentes de bifidobactéries (en plus des lactobacilles et des streptocoques) et les preuves limitées disponibles sur les bifidobactéries en tant que probiotiques les plus efficaces dans le SII (13) . Un organigramme de l'étude se trouve en annexe 1.

Évaluation de la semaine 4

Réponse clinique au traitement probiotique Des évaluations seront effectuées au départ et au jour 28 du traitement. Les trois symptômes du SII seront évalués pour déterminer la réponse au traitement : douleur/inconfort abdominal, ballonnement/distension et selles, chacun noté sur une échelle ordinale (échelle de Likert ; score maximum de 7) et sur une échelle visuelle analogique de 100 mm (EVA ; note maximale 100). Un score composite avec les sommes des 3 symptômes cardinaux sera également calculé pour chaque patient (échelle de Likert score maximum 21) (EVA ; score maximum 300). Des tests répétés de sensibilité rectale seront effectués.

Modifications du microbiote de la muqueuse en réponse à la thérapie probiotique Des évaluations seront effectuées au départ et au jour 28. En raison de la nature quelque peu invasive d'une coloscopie répétée, les enquêteurs n'effectueront qu'une sigmoïdoscopie flexible pour obtenir des biopsies rectales après un traitement probiotique.

Échantillons de la semaine 4 de l'IBS :

1. tissu rectal (formol fixé pour l'histologie)
2. tissus rectaux (polymorphisme SERT)
3. tissus rectaux (microbiote muqueux)

5ml de sang sur EDTA (polymorphisme SERT)

Suivi de six mois Les patients seront contactés à 6 mois pour réévaluer les scores des symptômes afin de déterminer l'impact à plus long terme du traitement.

COLOSCOPIE La coloscopie sera réalisée en ambulatoire sous sédation consciente avec du diazépam et de la péthidine par voie intraveineuse. Les sujets recevront une préparation intestinale avec PEG. Pour la sigmoïdoscopie flexible, un examen non préparé sera effectué et quatre biopsies seront obtenues à 15 cm de la marge anale.

BAROSTAT RECTAL Le dispositif barostat contient un système informatique intégré qui peut être programmé pour effectuer automatiquement des distensions de ballon avec des décalages de temps fixes et des incréments de pression du sac. La variation du volume du ballon à pression constante reflète le changement de tonus et de compliance de la paroi viscérale. De plus, grâce à une variation programmée de la pression intraballon, le seuil sensoriel du sujet peut être évalué.

Le patient est chargé d'administrer 4,5 fl oz de phosphates de sodium par voie rectale 4 heures avant l'étude à domicile pour un nettoyage rectal. Après un jeûne de 3 heures, le participant sera positionné en position latérale gauche. Un sac barostat est inséré dans le rectum. Le dispositif barostat est connecté au cathéter barostat à l'aide d'un tube en PVC à faible compliance.

Après 10 minutes de repos, des distensions rectales isobares phasiques sont réalisées automatiquement en utilisant le protocole de méthode ascendante des limites (AML) avec des incréments successifs de 4 mm Hg (durée de 40 secondes) alternant avec des périodes intermittentes de dégonflage du sac (40 secondes). Au cours de chaque phase de distension, le participant est invité à rapporter les notes de perception en appuyant sur le panneau de perception du dispositif barostat avec l'échelle suivante : (1) Aucune sensation de distension du ballon, (2) la première sensation de distension du ballon, (3) désir de défécation, (4) sensation maximale tolérable. La procédure sera arrêtée lorsque la douleur ou la sensation maximale tolérable est signalée. Le seuil sensoriel est défini comme la limite inférieure de la pression du ballon qui évoque la première sensation de distension du ballon. Le seuil de douleur est défini comme la pression qui provoque une réponse « douloureuse » ou une sensation maximale tolérable.

MICROBIOTE MUQUEUX Des échantillons coliques seront prélevés pour représenter la flore bactérienne adhérente. Tous les échantillons seront stockés à -80 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation. Chaque échantillon sera ajouté à des tubes contenant 500 µl de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (24:24:1) et 500 µl de billes de zircone/silice de 0,1 mm de diamètre (Biospec Products, Barthesville, OK). Les cellules microbiennes seront perturbées mécaniquement à 23 degrés Celsius avec un batteur à billes (Biospec Products, instrument réglé à haute température pendant 2 minutes). L'ADN isolé sera fractionné par électrophorèse sur des gels d'agarose à 1 %, et la bande dominante sera purifiée par le kit MiniElute Gel Extraction (Qiagen).

L'amplification des séquences d'ARN ribosomal bactérien 16S pour le pyroséquençage sera réalisée par PCR. Pour chaque échantillon, 100 à 200 mg d'ADN génomique purifié seront amplifiés à l'aide des amorces BSR357-A et BSF8-B, qui s'hybrident aux régions conservées du gène bactérien de l'ARNr 16s. Les produits de PCR seront séquencés à l'aide du système 454 Life Sciences Technology Genome Sequencer FLX (fourni par la Faculté des sciences, CUHK). Le contrôle qualité sera réalisé selon les critères suivants : la séquence doit (i) présenter une correspondance parfaite avec le code-barres et l'amorce du gène de l'ARN ribosomal 16S, (ii) avoir une longueur d'au moins 50 nucléotides, (iii) ne pas avoir plus de deux bases indéterminées dans la séquence lue, et (iv) ont au moins une correspondance de 75 % avec une séquence de gène d'ARN ribosomal 16S préalablement déterminée. Le regroupement et l'analyse des unités taxonomiques opérationnelles (OTU) seront effectués à l'aide d'OTUPicker. Le regroupement et l'analyse des coordonnées principales seront effectués à l'aide d'UniFrac. Étant donné que les erreurs de pyroséquençage se produisent à un taux de seulement 0,25 %, la plupart des séquences de 400 nucléotides qui restent après le filtrage contiendront 0 ou 1 erreur. Ce niveau d'erreur de séquençage n'affectera pas l'analyse taxonomique.

L'ensemble de données final pour l'analyse taxonomique microbienne du côlon sera comparé à la version 10 du projet de base de données ribosomique à 1 358 426 séquences.

POLYMORPHISME DES TRANSPORTEURS DE SEROTONINE Pour le génotypage, l'ADN sera isolé à partir de biopsies de plaquettes sanguines (de sang veineux) et de côlon par extraction standard au phénol/chloroforme.

Le polymorphisme d'insertion/délétion de 44 pb dans la région promotrice (SERT-P) sera analysé par PCR de l'ADN de l'échantillon avec l'amorce directe 5'-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3' et l'amorce inverse 5'-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3'. Les tailles de produit attendues sont respectivement de 484 pb pour la délétion (s) et de 528 pb pour l'insertion (l).

Le polymorphisme VNTR de 17 pb de l'intron 2 du gène SERT sera étudié par PCR d'un échantillon d'ADN avec l'amorce directe 5'-GTC AGT ATC ACA GGC TGC GAG-3' et l'amorce inverse 5'-TGT TCC TAG TCT TAC GCC AGT-3 '. Les tailles de produit attendues pour les allèles 9, 10, 11 et 12 sont respectivement de 253 bp, 270 bp, 287 bp et 304 bp.

Les expressions de la protéine SERT colique et plaquettaire seront également étudiées par PCR en temps réel et méthode de western blot.