原発性副甲状腺機能亢進症におけるビタミンD受容体（VDR）、カルシウム感知受容体（CaSR）、サイクリンD1、Ki67および増殖細胞核抗原（PCNA）の制御

序章：

原発性副甲状腺機能亢進症（PHPT）は、糖尿病および甲状腺疾患に次いで 3 番目に頻度の高い内分泌疾患で、主に閉経後の女性が罹患し、発生率は 1000 人に 1 ～ 5 人です。 年齢を問わず発症する可能性がありますが、若者が罹患することはほとんどありません。 PHPT は、副甲状腺ホルモン (PTH) の過剰分泌とその結果として生じる高カルシウム血症を特徴とします。 PHPT のほとんどの症例 (>85%) は、副甲状腺の 1 つにある孤立性腺腫に起因します。 多腺過形成は患者の約 10 ～ 15% に見られますが、癌腫はまれに発生します (1 ～ 2%)。

副甲状腺はカルシウムの恒常性を調節します。 副甲状腺ホルモン (PTH) の主な標的臓器は骨と腎臓です。 PTH は骨吸収を増加させ、カルシウムを循環に動員します。 腎臓では、PTH はカルシウムの再吸収を促進し、リン酸塩の排泄を増加させます。 PTH はまた、腎臓での 1α,25-ジヒドロキシビタミン D [1,25(OH)2D] の生成を刺激し、これにより腸でのカルシウムの吸収が促進されます。 したがって、PTH の生理学的効果は、循環中のカルシウム濃度を増加させることです。 カルシウムと 1,25(OH)2D からの負のフィードバックは副甲状腺機能を調節します。 これらの効果は、副甲状腺細胞表面に発現するカルシウム感知受容体 (CaSR) を介して媒介されます。 同様に、1,25(OH)2D はビタミン D 受容体 (VDR) を介して作用し、PTH の合成と分泌を抑制します。 したがって、PTH 分泌は副甲状腺細胞の周囲のカルシウム レベルと密接に関係しています。

副甲状腺細胞増殖の増加とカルシウムを介した PTH 分泌制御の低下は、すべてのタイプの副甲状腺機能亢進症における特徴的な所見です (1-4)。 この点において、その受容体である CaSR および 1,25(OH)2D-VDR 複合体を介したカルシウムは最も重要な調節因子です。 これらの調節因子の作用が低下すると、副甲状腺細胞の増殖が刺激されます。 分子分析により、腺腫のサブセットに腫瘍特異的な DNA 再構成が存在することが明らかになりました。 このような再構成では、5' PTH 遺伝子調節領域がサイクリン D1 遺伝子の上流と結合し、その結果、サイクリンの過剰発現が生じ、有糸分裂速度が上昇して増殖を誘導する可能性があります。 実際、サイクリン D1 の過剰発現は副甲状腺腺腫患者で初めて証明されました (5)。

CaSR 遺伝子発現の障害は、原発性および続発性副甲状腺機能亢進症の両方の副甲状腺病変で見られます (6-11)。 副甲状腺腫瘍の CaSR 遺伝子には変異は見つかりませんでした (11、12)。 同様の今回の発見は、VDR 遺伝子発現の低下を示し (8,13-15)、副甲状腺機能亢進症における VDR 遺伝子突然変異の明らかな欠如に関する研究と一致しています (16-18)。 VDR および CaSR 遺伝子の差次的発現がいくつかの副甲状腺腺腫で報告されていますが、正確なメカニズムは不明です。 これらの観察は、これらの遺伝子の発現の変化が副甲状腺腺腫の病因に関連している可能性を提起します。

目的: 上記の目的を達成するために、次の目的が達成されます。

1. リアルタイムPCRによる、副甲状腺腺腫におけるVDRおよびCaSR遺伝子の発現と、非副甲状腺機能亢進患者から手術中に得られた正常な副甲状腺組織との比較。
2. 免疫組織化学により副甲状腺細胞における VDR、CaSR、PTH サイクリン D1、Ki67、および PCNA の発現を確認します。
3. プロテオーム解析による副甲状腺腺腫のタンパク質発現プロファイルと正常な副甲状腺組織の比較。

材料および方法：

科目：

チャンディーガルのPGIMERにあるネルー病院の内分泌科および一般外科の屋外患者診療所に通うすべてのPHPT患者が、以下の包含基準および除外基準に従ってこの研究に含まれる。

包含基準: 外科的に確認された散発性 PHPT 患者および対照は以下のように含まれます。グループ A: 散発性 PHPT 患者約 20 名 グループ B: 甲状腺疾患で手術を受けた正常カルシウム血症正常甲状腺患者約 10 名は、対照組織として正常な副甲状腺組織を提供します。

除外基準：過形成、腎不全および多発性内分泌腫瘍を有する患者は除外される。

サンプル収集: 副甲状腺組織サンプルは手術直後に収集され、急速冷凍され、使用するまで-80℃で保存されます。

アッセイ方法: 術前の総血清カルシウム値 (基準範囲、8.6 ～ 10.2) mg/dL) は自動分析装置 (Modular P: Roche Diagnostics、ドイツ) によって測定されます。 血清カルシウム値は血清アルブミン値で補正されます。 血清インタクト PTH (参照範囲、12 ～ 55 ng/L) および 25-ヒドロキシビタミン D (11.1 ～ 42.9) ng/ml）は、免疫化学発光（ELECSYS-2010: Roche Diagnostics、ドイツ）を使用して測定されます。

1. VDR および CaSR の遺伝子発現研究 -

   1. RNA抽出:

      販売者の指示に従って、TRIZOL 試薬 (Life Technologies, Inc.) を使用して、凍結保存した正常および腺腫性副甲状腺組織サンプルから全 RNA を抽出します。 サンプルは DNase で前処理され、使用するまで -80℃ で保存されます。 cDNA は、ランダム六量体をプライマーとして使用した逆転写酵素によって 3 ～ 4 mg の RNA から生成されます。

   2. リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応:

   VDR および CaSR の mRNA レベルは、特定のプライマー配列と PCR 条件を使用した Real-PCR (Stratagene Robocycler Gradient 40 システム) によって推定されます。 PCR 産物は 6% アガロースゲルでの電気泳動によって分離されます。次に、製品は臭化エチジウムで染色され、UV 光を使用した蛍光によって位置が特定されます。 Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak、ニューヨーク州ロチェスター) を使用して、PCR バンドのバンド強度を評価します。

2. VDR、CaSR、PTH、Cyclin D1、Ki67、および PCNA タンパク質の発現研究 -

   免疫組織化学: モノクローナル抗体は、パラフィン切片上の VDR、CaSR、PTH、サイクリン D1、Ki67、および PCNA タンパク質の免疫染色に使用されます (出典 - Pharmingen、米国)。 一次抗体に特異的な二次抗体、ヤギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体（BD Biosciences、ファーミンゲン、米国）を各試験で使用します。 パラフィン切片の染色には間接免疫ペルオキシダーゼ法が使用されます。 このアッセイでは、結合していない一次抗体が検体中の抗原に結合します。 この結合の位置を特定するために、一次抗体に結合するペルオキシダーゼ結合特異的二次抗体が使用されます。 次に、反応を局所化するために基質が追加されます。

   次に、スライドを光学顕微鏡で検査します。 染色は、免疫反応性の強度に応じて、陰性 (0)、軽度 (+)、中程度 (++)、および顕著 (+++) に等級分けされます。

3. タンパク質発現プロファイルの比較-

   1. タンパク質の抽出 100mg の組織を 0.5 ml の冷（4℃）溶解緩衝液でホモジナイズします。 タンパク質はビシン慢性酸 (BCA) 法によって推定され、残りは -80°C で保存されます。

   2. 一次元目 (IEF) と二次元目 (SDS-PAGE) の分離 濃縮されたサンプルは再水和バッファーで可溶化されます。 合計 125 ～ 200 μl を 7 cm IPG ストリップ (Amersham) にロードします。 IEF の実行はメーカーのプロトコルに従って行われます。

      2 次元目では、IPG ストリップを 6 ml の平衡化バッファーで 15 分間平衡化します。 各 IPG ストリップを 12% ポリアクリルアミドゲルにロードし、電気泳動します (100 または 200 V で約 6 時間)。 電気泳動後、タンパク質は固定され、クーマシー染色と銀染色を使用して視覚化されます。

   3. 画像解析、ゲル内トリプシン消化、および MALDI 質量分析分析 染色されたゲルは、PDQuest ソフトウェア (Bio-Rad) を使用して GS-800 濃度計 (Bio-Rad) でスキャンされ、目的のタンパク質は MALDI-TOFMS ( Voyager DE-PRO、Applied Biosystems)、微生物技術研究所 (IMTech)。

タンパク質は、ペプチド質量スペクトルの助けを借りて、Mascot Web ベースの検索エンジンを使用したペプチド質量フィンガープリンティングによって同定されます。