Regulierung des Vitamin-D-Rezeptors (VDR), des Calcium-Sensing-Rezeptors (CaSR), Cyclin D1, Ki67 und des proliferierenden Zellkernantigens (PCNA) bei primärem Hyperparathyreoidismus

Einführung:

Primärer Hyperparathyreoidismus (PHPT) ist nach Diabetes mellitus und Schilddrüsenerkrankungen die dritthäufigste endokrine Erkrankung, die mit einer Inzidenz von 1 bis 5 von 1000 Menschen vorwiegend postmenopausale Frauen betrifft. Es kann in jedem Alter auftreten, junge Menschen sind jedoch selten betroffen. PHPT ist durch eine Hypersekretion des Parathormons (PTH) und eine daraus resultierende Hyperkalzämie gekennzeichnet. Die meisten Fälle von PHPT (>85 %) resultieren aus einem solitären Adenom in einer der Nebenschilddrüsen. Eine Multidrüsenhyperplasie findet sich bei etwa 10–15 % der Patienten, während ein Karzinom selten (1–2 %) auftritt.

Die Nebenschilddrüsen regulieren die Kalziumhomöostase. Die wichtigsten Zielorgane für Parathormon (PTH) sind Knochen und Nieren. PTH erhöht die Knochenresorption, um Kalzium in den Kreislauf zu mobilisieren. In der Niere fördert PTH die Kalziumrückresorption und erhöht die Phosphatausscheidung. PTH stimuliert auch die renale Produktion von 1α,25-Dihydroxyvitamin D [1,25(OH)2D], was wiederum die Darmabsorption von Kalzium steigert. Somit besteht die physiologische Wirkung von PTH darin, die Kalziumkonzentration im Kreislauf zu erhöhen. Negative Rückkopplungen von Kalzium und 1,25(OH)2D modulieren die Nebenschilddrüsenfunktion. Diese Effekte werden über den Calcium-Sensing-Rezeptor (CaSR) vermittelt, der auf der Zelloberfläche der Nebenschilddrüse exprimiert wird. In ähnlicher Weise wirkt 1,25(OH)2D über den Vitamin-D-Rezeptor (VDR) und unterdrückt die PTH-Synthese und -Sekretion. Somit ist die PTH-Sekretion eng an den umgebenden Kalziumspiegel der Nebenschilddrüsenzelle gekoppelt.

Eine erhöhte Proliferation von Nebenschilddrüsenzellen und eine verminderte kalziumvermittelte Kontrolle der PTH-Sekretion sind charakteristische Befunde bei allen Arten von Hyperparathyreoidismus (1-4). Dabei sind Calcium über seinen Rezeptor, den CaSR und den 1,25(OH)2D-VDR-Komplex die wichtigsten Regulatoren. Eine verminderte Wirkung dieser Regulatoren würde die Proliferation der Nebenschilddrüsenzellen anregen. Molekulare Analysen haben das Vorhandensein tumorspezifischer DNA-Umlagerungen in einer Untergruppe von Adenomen ergeben. Bei solchen Umlagerungen verbindet sich die regulatorische Region des 5'-PTH-Gens stromaufwärts des Cyclin-D1-Gens, was zu einer Überexpression von Cyclinen führt, die durch eine Erhöhung der Mitoserate die Proliferation induzieren könnte. Tatsächlich wurde eine Überexpression von Cyclin D1 erstmals bei einem Patienten mit Nebenschilddrüsenadenom nachgewiesen (5).

Eine beeinträchtigte CaSR-Genexpression findet sich in Nebenschilddrüsenläsionen sowohl beim primären als auch beim sekundären Hyperparathyreoidismus (6-11). Bei Nebenschilddrüsenneoplasien konnten keine Mutationen im CaSR-Gen gefunden werden (11,12). Ähnliche aktuelle Ergebnisse zeigen eine verringerte VDR-Genexpression (8,13–15) und stimmen mit Studien über das offensichtliche Fehlen von VDR-Genmutationen bei Hyperparathyreoidismus überein (16–18). Bei einigen Nebenschilddrüsenadenomen wurde über eine unterschiedliche Expression des VDR- und CaSR-Gens berichtet, der genaue Mechanismus ist jedoch nicht bekannt. Diese Beobachtungen lassen darauf schließen, dass eine veränderte Expression dieser Gene mit der Pathogenese von Nebenschilddrüsenadenomen zusammenhängen könnte.

ZIELE: Um das oben genannte Ziel zu erreichen, würden die folgenden Ziele verfolgt.

1. Vergleich der Expression von VDR- und CaSR-Genen in Nebenschilddrüsenadenomen mit normalem Nebenschilddrüsengewebe, das während einer Operation von Patienten ohne Nebenschilddrüsenüberfunktion mittels Real-Time-PCR gewonnen wurde.
2. Zur Bestätigung der Expression von VDR, CaSR, PTH Cyclin D1, Ki67 und PCNA in Nebenschilddrüsenzellen durch Immunhistochemie.
3. Vergleich des Proteinexpressionsprofils von Nebenschilddrüsenadenomen mit normalem Nebenschilddrüsengewebe durch Proteomanalyse.

MATERIALEN UND METHODEN:

Fächer:

Alle PHPT-Patienten, die die Außenklinik für Endokrinologie und allgemeine Chirurgie des Nehru Hospital, PGIMER, Chandigarh besuchen, werden in diese Studie mit den folgenden Einschluss- und Ausschlusskriterien einbezogen.

Einschlusskriterien: Patienten mit chirurgisch verifiziertem sporadischem PHPT und Kontrollen werden wie folgt eingeschlossen; Gruppe A: ~ 20 sporadische PHPT-Patienten. Gruppe B: ~ 10 Patienten mit normokalzämischer Euthyreose, die wegen Schilddrüsenerkrankungen operiert wurden, liefern normales Nebenschilddrüsengewebe, das als Kontrollgewebe dient.

Ausschlusskriterien: Patienten mit Hyperplasie, Nierenversagen und multipler endokriner Neoplasie werden ausgeschlossen.

Probenentnahme: Nebenschilddrüsengewebeproben werden unmittelbar nach der Operation entnommen, eingefroren und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert.

Testmethoden: Präoperative Werte des Gesamtserumkalziums (Referenzbereich 8,6–10,2). mg/dL) wird mit einem Autoanalysator (Modular P: Roche Diagnostics, Deutschland) bestimmt. Der Serumkalziumspiegel wird mit dem Serumalbuminspiegel korrigiert. Das intakte Serum-PTH (Referenzbereich 12–55 ng/L) und 25-Hydroxyvitamin D (11,1–42,9). ng/ml) wird mittels Immunchemiluminiszenz gemessen (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Deutschland).

1. Genexpressionsstudie für VDR und CaSR-

   1. RNA-Extraktion:

      Die Gesamt-RNA wird aus den kryokonservierten normalen und adenomatösen Nebenschilddrüsengewebeproben mithilfe des TRIZOL-Reagenzes (Life Technologies, Inc.) gemäß den Anweisungen des Anbieters extrahiert. Die Proben werden mit DNase vorbehandelt und bis zur Verwendung bei -80 °C gelagert. Die cDNA wird aus den 3–4 mg RNA durch Reverse Transkriptase mit zufälligen Hexameren als Primern generiert.

   2. Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion:

   Die mRNA-Spiegel von VDR und CaSR werden durch Real-PCR (Stratagene Robocycler Gradient 40-System) unter Verwendung spezifischer Primersequenzen und PCR-Bedingungen geschätzt. Die PCR-Produkte werden durch Elektrophorese auf 6 % Agarosegel aufgetrennt; Anschließend werden die Produkte mit Ethidiumbromid angefärbt und durch Fluoreszenz unter Verwendung von UV-Licht lokalisiert. Zur Bewertung der Bandenintensitäten der PCR-Banden würde Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) verwendet werden.

2. Expressionsstudie von VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 und PCNA-Protein-

   Immunhistochemie: Monoklonale Antikörper werden zur Immunfärbung von VDR-, CaSR-, PTH-, Cyclin D1-, Ki67- und PCNA-Proteinen auf Paraffinschnitten verwendet (Quelle – Pharmingen, USA). In jedem Test werden Sekundärantikörper, Ziegen-Anti-Maus-Meerrettich-Peroxidase-konjugiert (BD Biosciences, Pharmingen, USA), spezifisch für Primärantikörper, verwendet. Für die Färbung von Paraffinschnitten wird die indirekte Immunoperoxidase-Methode verwendet. Bei diesem Test bindet der unkonjugierte Primärantikörper an das Antigen in der Probe. Um diese Bindung zu lokalisieren, wird ein Peroxidase-konjugierter spezifischer Sekundärantikörper verwendet, der an den Primärantikörper bindet. Anschließend wird ein Substrat hinzugefügt, um die Reaktion zu lokalisieren.

   Anschließend werden die Objektträger unter dem Lichtmikroskop untersucht. Die Färbung wird je nach Intensität der Immunreaktivität als negativ (0), leicht (+), mäßig (++) und deutlich (+++) eingestuft.

3. Vergleich des Proteinexpressionsprofils

   1. Extraktion von Proteinen 100 mg Gewebe werden mit 0,5 ml kaltem (4 °C) Lysepuffer homogenisiert. Das Protein wird mithilfe der BCA-Methode (Bicin Chronic Acid) geschätzt und der Rest bei -80 °C gelagert.

   2. Trennung in erster Dimension (IEF) und zweiter Dimension (SDS-PAGE) Die konzentrierte Probe wird in Rehydratisierungspuffer solubilisiert. Insgesamt werden 125–200 µl auf einen 7-cm-IPG-Streifen (Amersham) geladen. Der IEF-Lauf erfolgt gemäß dem Protokoll des Herstellers.

      Für die zweite Dimension werden die IPG-Streifen 15 Minuten lang mit 6 ml Äquilibrierungspuffer äquilibriert. Jeder IPG-Streifen wird auf 12 % Polyacrylamidgel geladen und einer Elektrophorese unterzogen (100 oder 200 V für ca. 6 Stunden). Nach der Elektrophorese werden die Proteine ​​fixiert und mithilfe von Coomassie- und Silberfärbungen sichtbar gemacht.

   3. Bildanalyse, Trypsinverdau im Gel und MALDI-Massenspektrometrieanalyse. Gefärbte Gele werden mit dem Densitometer GS-800 (Bio-Rad) unter Verwendung der PDQuest-Software (Bio-Rad) gescannt und die interessierenden Proteine ​​werden mit dem MALDI-TOFMS analysiert ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) am Institut für Mikrobielle Technologie (IMTech).

Proteine ​​werden durch Peptid-Massen-Fingerprinting mithilfe der webbasierten Suchmaschine Mascot mithilfe von Peptid-Massenspektren identifiziert.