Regulace receptoru vitamínu D (VDR), receptoru pro snímání vápníku (CaSR), cyklinu D1, Ki67 a nukleárního antigenu proliferujících buněk (PCNA) u primární hyperparatyreózy

Úvod:

Primární hyperparatyreóza (PHPT) je po diabetes mellitus a poruchách štítné žlázy třetí nejčastější endokrinní poruchou, která postihuje převážně ženy po menopauze s incidencí 1-5 z 1000 osob. Může se objevit v jakémkoli věku, ačkoli mladí lidé jsou postiženi zřídka. PHPT je charakterizováno hypersekrecí parathormonu (PTH) a následnou hyperkalcémií. Většina případů PHPT (>85 %) je výsledkem solitárního adenomu v jednom z příštítných tělísek. Multi-gland hyperplazie se vyskytuje asi u 10-15% pacientů, zatímco karcinom se vyskytuje vzácně (1-2%).

Příštitná tělíska regulují homeostázu vápníku. Hlavními cílovými orgány pro parathormon (PTH) jsou kosti a ledviny. PTH zvyšuje kostní resorpci k mobilizaci vápníku do oběhu. V ledvinách PTH zvyšuje reabsorpci vápníku a zvyšuje vylučování fosfátů. PTH také stimuluje renální produkci 1α,25-dihydroxyvitamínu D [1,25(OH)2D], což zase zvyšuje střevní absorpci vápníku. Fyziologickým účinkem PTH je tedy zvýšení koncentrace vápníku v oběhu. Negativní zpětná vazba z vápníku a 1,25(OH)2D modulují funkci příštítných tělísek. Tyto účinky jsou zprostředkovány prostřednictvím receptoru citlivého na vápník (CaSR) exprimovaného na povrchu příštítných tělísek. Podobně 1,25(OH)2D působí prostřednictvím receptoru vitaminu D (VDR) a potlačuje syntézu a sekreci PTH. Sekrece PTH je tedy těsně spojena s okolní hladinou vápníku v buňkách příštítných tělísek.

Zvýšená proliferace buněk příštítných tělísek a snížení kalciem zprostředkované kontroly sekrece PTH jsou charakteristické nálezy u všech typů hyperparatyreózy (1-4). Nejdůležitějšími regulátory jsou v tomto ohledu vápník prostřednictvím svého receptoru, CaSR a komplexu 1,25(OH)2D-VDR. Snížený účinek těchto regulátorů by stimuloval buňky příštítných tělísek k proliferaci. Molekulární analýzy odhalily přítomnost nádorově specifických přeuspořádání DNA v podskupině adenomů. V takových přestavbách se regulační oblast genu 5' PTH spojuje upstream od genu cyklinu D1, což vede k nadměrné expresi cyklinů, které by mohly indukovat proliferaci zvýšením mitotické rychlosti. Nadměrná exprese cyklinu D1 byla ve skutečnosti poprvé prokázána u pacienta s adenomem příštítných tělísek (5).

Porucha genové exprese CaSR se nachází v lézích příštítných tělísek primární i sekundární hyperparatyreózy (6-11). U neoplazií příštítných tělísek nebyly nalezeny žádné mutace v genu CaSR (11,12). Podobné současné nálezy ukazují sníženou expresi genu VDR (8,13-15) a shodují se se studiemi o zjevném nedostatku mutací genu VDR u hyperparatyreózy (16-18). Diferenciální exprese genu VDR a CaSR byla popsána u několika adenomů příštítných tělísek, ale přesný mechanismus není znám. Tato pozorování zvyšují možnost, že by změněná exprese těchto genů mohla souviset s patogenezí adenomů příštítných tělísek.

CÍLE: K dosažení výše uvedeného cíle by byly splněny následující cíle.

1. Srovnání exprese genů VDR a CaSR v adenomech příštítných tělísek s normální tkání příštítných tělísek získaných během operace od nehyperparatyreoidálních pacientů pomocí Real Time-PCR.
2. Imunohistochemicky potvrdit expresi VDR, CaSR, PTH cyklinu D1, Ki67 a PCNA v buňkách příštítných tělísek.
3. Srovnání profilu proteinové exprese adenomů příštítných tělísek s normální tkání příštítných tělísek pomocí proteomické analýzy.

MATERIÁLY A METODY:

Předměty:

Všichni pacienti s PHPT navštěvující venkovní kliniku endokrinologie a všeobecné chirurgie nemocnice Nehru, PGIMER, Chandigarh, budou zahrnuti do této studie s následujícími kritérii pro zařazení a vyloučení.

Kritéria pro zařazení: Pacienti s chirurgicky ověřenou sporadickou PHPT a kontroly budou zahrnuti následovně; Skupina A: ~ 20 sporadických pacientů s PHPT Skupina B: ~ 10 normokalcemických eutyreoidních pacientů operovaných pro poruchy štítné žlázy poskytne normální tkáň příštítných tělísek, která bude sloužit jako kontrolní tkáň.

Kritéria vyloučení: Pacienti s hyperplazií, renálním selháním a mnohočetnou endokrinní neoplazií budou vyloučeni.

Odběr vzorků: Vzorky tkáně příštítných tělísek budou odebrány ihned po operaci, rychle zmraženy a uchovávány při -80oC až do použití.

Metody stanovení: Předoperační hladiny celkového sérového vápníku (referenční rozmezí, 8,6-10,2 mg/dL) bude stanovena autoanalyzátorem (Modular P: Roche Diagnostics, Německo). Hladina sérového vápníku bude korigována hladinou sérového albuminu. Sérum intaktní PTH (referenční rozmezí, 12-55 ng/l) a 25-hydroxyvitamín D (11,1-42,9 ng/ml) bude měřena pomocí imunochemiluminiscence (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Německo).

1. Studie genové exprese pro VDR a CaSR-

   1. Extrakce RNA:

      Celková RNA bude extrahována z kryokonzervovaných vzorků normální a adenomatózní tkáně příštítných tělísek pomocí činidla TRIZOL (Life Technologies, Inc.), podle pokynů dodavatele. Vzorky budou předem ošetřeny DNázou a skladovány při -80oC až do použití. cDNA bude generována z 3-4 mg RNA reverzní transkriptázou s náhodnými hexamery jako primery.

   2. Polymerázová řetězová reakce v reálném čase:

   Hladiny mRNA VDR a CaSR budou odhadnuty pomocí Real-PCR (systém Stratagene Robocycler Gradient 40) za použití specifických sekvencí primerů a podmínek PCR. Produkty PCR budou separovány elektroforézou na 6% agarózovém gelu; produkty budou poté obarveny ethidium bromidem a lokalizovány fluorescencí pomocí UV světla. Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) by se použil k vyhodnocení intenzit pásů PCR pásů.

2. Studie exprese VDR, CaSR, PTH, cyklinu D1, Ki67 a PCNA protein-

   Imunohistochemie: Monoklonální protilátky budou použity pro imunobarvení VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 a PCNA proteinů na parafinových řezech (Source-Pharmingen, USA). V každém testu bude použita sekundární protilátka, konjugovaná kozí anti-myší křenová peroxidáza (BD Biosciences, Pharmingen, USA), specifická pro primární protilátky. Pro barvení parafinových řezů bude použita nepřímá imunoperoxidázová metoda. V tomto testu se nekonjugovaná primární protilátka váže na antigen ve vzorku. K lokalizaci tohoto připojení se používá specifická sekundární protilátka konjugovaná s peroxidázou, která se váže na primární protilátku. Poté se přidá substrát pro lokalizaci reakce.

   Sklíčka pak budou zkoumána pod světelným mikroskopem. Barvení bude klasifikováno jako negativní (0), mírné (+), střední (++) a výrazné (+++) v závislosti na intenzitě imunoreaktivity.

3. Srovnání profilu proteinové exprese -

   1. Extrakce proteinů 100 mg tkáně bude homogenizováno s 0,5 ml studeného (4°C) lyzačního pufru. Protein bude odhadnut metodou Bicin chronic Acid (BCA) a zbytek bude uchováván při -80°C.

   2. Separace první dimenze (IEF) a druhé dimenze (SDS-PAGE) Koncentrovaný vzorek bude solubilizován v rehydratačním pufru. Celkem 125 - 200 µl bude naloženo na 7 cm IPG proužek (Amersham). IEF běh bude podle protokolu výrobce.

      Pro druhý rozměr budou proužky IPG ekvilibrovány po dobu 15 minut pomocí 6 ml ekvilibračního pufru. Každý proužek IPG bude vložen na 12% polyakrylamidový gel a podroben elektroforéze (100 nebo 200 V po dobu ~6 hodin). Po elektroforéze budou proteiny fixovány a jsou vizualizovány pomocí barviv Coomassie a Silver.

   3. Analýza obrazu, štěpení trypsinem v gelu a analýza hmotnostní spektrometrií MALDI Obarvené gely budou skenovány denzitometrem GS-800 (Bio-Rad) pomocí softwaru PDQuest (Bio-Rad) a sledované proteiny budou analyzovány pomocí MALDI-TOFMS ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) na Institutu mikrobiální technologie (IMTech).

Proteiny budou identifikovány pomocí peptidového hmotnostního otisku pomocí webového vyhledávače Mascot s pomocí peptidových hmotnostních spekter.