Regulatie van vitamine D-receptor (VDR), calciumgevoelige receptor (CaSR), cycline D1, Ki67 en prolifererend celnucleair antigeen (PCNA) bij primaire hyperparathyreoïdie

Invoering:

Primaire hyperparathyreoïdie (PHPT) is de op twee na meest voorkomende endocriene aandoening, na diabetes mellitus en schildklieraandoeningen, die voornamelijk postmenopauzale vrouwen treft, met een incidentie van 1-5 op de 1000 mensen. Het kan op elke leeftijd voorkomen, hoewel jonge mensen zelden worden getroffen. PHPT wordt gekenmerkt door hypersecretie van bijschildklierhormoon (PTH) en resulterende hypercalciëmie. De meeste gevallen van PHPT (>85%) zijn het gevolg van een solitair adenoom in een van de bijschildklieren. Multi-klierhyperplasie wordt gevonden bij ongeveer 10-15% van de patiënten, terwijl carcinoom zelden voorkomt (1-2%).

De bijschildklieren reguleren de calciumhomeostase. De belangrijkste doelorganen voor bijschildklierhormoon (PTH) zijn botten en de nieren. PTH verhoogt de botresorptie om calcium in de bloedsomloop te mobiliseren. In de nieren bevordert PTH de reabsorptie van calcium en de uitscheiding van fosfaat. PTH stimuleert ook de nierproductie van 1α,25-dihydroxyvitamine D [1,25(OH)2D], wat op zijn beurt de opname van calcium in de darm bevordert. De fysiologische effecten van PTH zijn dus het verhogen van de calciumconcentratie in de bloedsomloop. Negatieve feedback van calcium en 1,25(OH)2D moduleert de bijschildklierfunctie. Deze effecten worden gemedieerd via de calcium-sensing receptor (CaSR) die tot expressie komt op het bijschildklierceloppervlak. Evenzo werkt 1,25 (OH) 2D via vitamine D-receptor (VDR) en onderdrukt het de synthese en secretie van PTH . Aldus is PTH-secretie nauw gekoppeld aan het omgevingscalciumniveau van de bijschildkliercel.

Verhoogde proliferatie van bijschildkliercellen en verminderde door calcium gemedieerde controle van de PTH-secretie zijn kenmerkende bevindingen bij alle vormen van hyperparathyroïdie (1-4). Calcium via zijn receptor, de CaSR en het 1,25(OH)2D-VDR-complex zijn hierbij de belangrijkste regulatoren. Verminderde acties van deze regulatoren zouden de bijschildkliercellen stimuleren om te prolifereren. Moleculaire analyses hebben de aanwezigheid van tumorspecifieke DNA-herschikkingen in een subset van adenomen onthuld. Bij dergelijke herschikkingen combineert het 5'-PTH-genregulerende gebied stroomopwaarts van het Cyclin D1-gen, wat resulteert in overexpressie van cyclines die proliferatie zouden kunnen induceren door de mitotische snelheid te verhogen. In feite werd overexpressie van Cyclin D1 voor het eerst aangetoond bij een patiënt met bijschildklieradenoom (5).

Verminderde CaSR-genexpressie wordt gevonden in bijschildklierlaesies van zowel primaire als secundaire hyperparathyreoïdie (6-11). Er konden geen mutaties worden gevonden in het CaSR-gen bij bijschildklierneoplasieën (11,12). Vergelijkbare huidige bevindingen tonen verminderde VDR-genexpressie (8,13-15) en komen overeen met studies over het schijnbare ontbreken van VDR-genmutaties bij hyperparathyreoïdie (16-18). Differentiële expressie van het VDR- en CaSR-gen is gemeld bij enkele bijschildklieradenomen, maar het exacte mechanisme is niet bekend. Deze waarnemingen verhogen de mogelijkheid dat veranderde expressie van deze genen gerelateerd zou kunnen zijn aan de pathogenese van bijschildklieradenomen.

DOELSTELLINGEN: Om het bovenstaande doel te bereiken, zouden de volgende doelstellingen worden nagestreefd.

1. Vergelijking van expressie van VDR- en CaSR-genen in bijschildklieradenomen met normaal bijschildklierweefsel verkregen tijdens chirurgie van niet-hyperparathyroïde patiënten door Real Time-PCR.
2. Om expressie van VDR, CaSR, PTH cycline D1, Ki67 en PCNA in bijschildkliercellen te bevestigen door middel van immunohistochemie.
3. Vergelijking van eiwitexpressieprofiel van bijschildklieradenomen met normaal bijschildklierweefsel door proteomische analyse.

MATERIALEN EN METHODES:

Onderwerpen:

Alle PHPT-patiënten die een buitenkliniek bezoeken van de afdeling Endocrinologie en Algemene Chirurgie van het Nehru-ziekenhuis, PGIMER, Chandigarh, zullen voor deze studie worden opgenomen met de volgende inclusie- en exclusiecriteria.

Inclusiecriteria: patiënten met chirurgisch geverifieerde sporadische PHPT en controles zullen als volgt worden opgenomen; Groep A: ~ 20 sporadische PHPT-patiënten Groep B: ~ 10 normocalciëmische euthyroïde patiënten die geopereerd zijn voor schildklieraandoeningen zullen normaal bijschildklierweefsel leveren om als controleweefsel te dienen.

Uitsluitingscriteria: Patiënten met hyperplasie, nierfalen en multipele endocriene neoplasie worden uitgesloten.

Monsterafname: Bijschildklierweefselmonsters worden direct na de operatie verzameld, snel ingevroren en tot gebruik bij -80oC bewaard.

Testmethoden: preoperatieve niveaus van totaal serumcalcium (referentiebereik, 8,6-10,2 mg/dL) wordt bepaald door een autoanalysator (Modular P: Roche Diagnostics, Duitsland). Het serumcalciumgehalte wordt gecorrigeerd met het serumalbuminegehalte. Het serum intact PTH (referentiebereik, 12-55 ng/L) en 25-hydroxyvitamine D (11.1-42.9 ng/ml) zal worden gemeten met behulp van immunochemiluminescentie (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Duitsland).

1. Genexpressiestudie voor VDR en CaSR-

   1. RNA-extractie:

      Totaal RNA zal worden geëxtraheerd uit de gecryopreserveerde normale en adenomateuze bijschildklierweefselmonsters met behulp van het TRIZOL-reagens (Life Technologies, Inc.), volgens de instructies van de leverancier. De monsters worden voorbehandeld met DNase en tot gebruik bewaard bij -80oC. Het cDNA zal worden gegenereerd uit de 3-4 mg RNA door reverse transcriptase met willekeurige hexameren als primers.

   2. Realtime polymerasekettingreactie:

   De mRNA-niveaus van VDR en CaSR zullen worden geschat door Real-PCR (Stratagene Robocycler Gradient 40-systeem) met behulp van specifieke primersequenties en PCR-omstandigheden. De PCR-producten worden gescheiden door elektroforese op 6% agarosegel; de producten worden vervolgens gekleurd met ethidiumbromide en gelokaliseerd door fluorescentie met behulp van UV-licht. Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) zou worden gebruikt om de bandintensiteiten van de PCR-banden te evalueren.

2. Expressiestudie van VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 en PCNA eiwit-

   Immunohistochemie: Monoklonale antilichamen zullen worden gebruikt voor immunokleuring van VDR-, CaSR-, PTH-, Cyclin D1-, Ki67- en PCNA-eiwitten op paraffinesecties (Bron Pharmingen, VS). Secundair antilichaam, geconjugeerd anti-muis-mierikswortelperoxidase van geit (BD Biosciences, Pharmingen, VS), specifiek voor primaire antilichamen, zal in elke test worden gebruikt. De indirecte immunoperoxidasemethode zal worden gebruikt voor het kleuren van paraffinecoupes. Bij deze assay bindt het ongeconjugeerde primaire antilichaam zich aan het antigeen in het monster. Om deze aanhechting te lokaliseren, wordt een peroxidase-geconjugeerd specifiek secundair antilichaam gebruikt dat aan het primaire antilichaam bindt. Vervolgens wordt een substraat toegevoegd om de reactie te lokaliseren.

   De objectglaasjes worden vervolgens onder de lichtmicroscoop onderzocht. Kleuring wordt beoordeeld als negatief (0), mild (+), matig (++) en gemarkeerd (+++), afhankelijk van de intensiteit van de immunoreactiviteit.

3. Vergelijking van eiwitexpressieprofiel-

   1. Extractie van eiwitten 100 mg weefsel wordt gehomogeniseerd met 0,5 ml koude (4°C) lysisbuffer. Eiwitten worden geschat met de Bicin Chronic Acid (BCA)-methode en de rest wordt bewaard bij -80°C.

   2. Scheiding in de eerste dimensie (IEF) en in de tweede dimensie (SDS-PAGE) Het geconcentreerde monster wordt opgelost in rehydratatiebuffer. Er zal in totaal 125 - 200 µl worden geladen op een IPG-strip van 7 cm (Amersham). De IEF-run zal plaatsvinden volgens het protocol van de fabrikant.

      Voor de tweede dimensie worden de IPG-strips gedurende 15 minuten geëquilibreerd met 6 ml equilibratiebuffer. Elke IPG-strip wordt op 12% polyacrylamidegel geladen en geëlektroforeerd (100 of 200 V gedurende ~ 6 uur). Na elektroforese worden eiwitten gefixeerd en gevisualiseerd met behulp van Coomassie- en zilverkleuring.

   3. Beeldanalyse, in-gel trypsine-digestie en MALDI-massaspectrometrische analyse Gekleurde gels worden gescand met GS-800 densitometer (Bio-Rad) met behulp van PDQuest-software (Bio-Rad) en de eiwitten van belang worden geanalyseerd door de MALDI-TOFMS ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) bij Instituut voor microbiële technologie (IMTech).

Eiwitten zullen worden geïdentificeerd door middel van peptide-massa-vingerafdrukken met behulp van de op het web gebaseerde zoekmachine Mascot met behulp van peptide-massaspectra.