Regulacja receptora witaminy D (VDR), receptora wyczuwającego wapń (CaSR), cykliny D1, Ki67 i proliferującego antygenu jądrowego komórki (PCNA) w pierwotnej nadczynności przytarczyc

Wstęp:

Pierwotna nadczynność przytarczyc (PHPT) jest trzecim co do częstości zaburzeniem endokrynologicznym, po cukrzycy i chorobach tarczycy, które dotyka głównie kobiety po menopauzie, z częstością 1-5 na 1000 osób. Może wystąpić w każdym wieku, chociaż rzadko dotyka młodych ludzi. PHPT charakteryzuje się nadmiernym wydzielaniem parathormonu (PTH) i wynikającą z tego hiperkalcemią. Większość przypadków PHPT (>85%) wynika z pojedynczego gruczolaka w jednej z przytarczyc. Rozrost wielogruczołowy stwierdza się u około 10-15% chorych, natomiast rak występuje rzadko (1-2%).

Przytarczyce regulują homeostazę wapnia. Głównymi narządami docelowymi dla parathormonu (PTH) są kości i nerki. PTH zwiększa resorpcję kości w celu mobilizacji wapnia do krążenia. W nerkach PTH zwiększa wchłanianie zwrotne wapnia i zwiększa wydalanie fosforanów. PTH stymuluje również nerkowe wytwarzanie 1α,25-dihydroksywitaminy D [1,25(OH)2D], co z kolei zwiększa jelitowe wchłanianie wapnia. Fizjologicznym działaniem PTH jest więc zwiększenie stężenia wapnia w krążeniu. Negatywne sprzężenie zwrotne z wapnia i 1,25(OH)2D moduluje czynność przytarczyc. W efektach tych pośredniczy receptor wykrywający wapń (CaSR) wyrażany na powierzchni komórek przytarczyc. Podobnie 1,25(OH)2D działa poprzez receptor witaminy D (VDR) i hamuje syntezę i wydzielanie PTH. Zatem wydzielanie PTH jest ściśle powiązane z poziomem wapnia w komórkach przytarczyc.

Zwiększona proliferacja komórek przytarczyc i zmniejszona zależna od wapnia kontrola wydzielania PTH są objawami charakterystycznymi dla wszystkich typów nadczynności przytarczyc (1-4). Najważniejszymi regulatorami pod tym względem są wapń poprzez swój receptor, CaSR i kompleks 1,25(OH)2D-VDR. Zmniejszone działanie tych regulatorów stymulowałoby proliferację komórek przytarczyc. Analizy molekularne wykazały obecność specyficznych dla nowotworu rearanżacji DNA w podgrupie gruczolaków. W takich rearanżacjach region regulatorowy genu 5' PTH łączy się powyżej genu cykliny D1, co skutkuje nadmierną ekspresją cyklin, które mogą indukować proliferację poprzez zwiększenie szybkości mitozy. W rzeczywistości nadekspresję cykliny D1 po raz pierwszy wykazano u pacjenta z gruczolakiem przytarczyc (5).

Upośledzoną ekspresję genu CaSR stwierdza się w zmianach przytarczyc zarówno pierwotnej, jak i wtórnej nadczynności przytarczyc (6-11). Nie stwierdzono mutacji w genie CaSR w nowotworach przytarczyc (11,12). Podobne obecne wyniki wskazują na zmniejszoną ekspresję genu VDR (8,13-15) i zgadzają się z badaniami nad ewidentnym brakiem mutacji genu VDR w nadczynności przytarczyc (16-18). Zróżnicowana ekspresja genów VDR i CaSR została opisana w kilku gruczolakach przytarczyc, ale dokładny mechanizm nie jest znany. Obserwacje te wskazują na możliwość, że zmieniona ekspresja tych genów może być związana z patogenezą gruczolaków przytarczyc.

CELE: Aby osiągnąć powyższy cel, zostaną podjęte następujące cele.

1. Porównanie ekspresji genów VDR i CaSR w gruczolakach przytarczyc z prawidłową tkanką przytarczyc uzyskaną podczas operacji od pacjentów bez nadczynności przytarczyc metodą Real Time-PCR.
2. Potwierdzenie ekspresji VDR, CaSR, cykliny PTH D1, Ki67 i PCNA w komórkach przytarczyc metodą immunohistochemiczną.
3. Porównanie profilu ekspresji białek gruczolaków przytarczyc z prawidłową tkanką przytarczyc metodą analizy proteomicznej.

MATERIAŁY I METODY:

Przedmioty:

Wszyscy pacjenci z PHPT uczęszczający do otwartej kliniki na oddziale endokrynologii i chirurgii ogólnej szpitala Nehru, PGIMER, Chandigarh zostaną włączeni do tego badania z następującymi kryteriami włączenia i wyłączenia.

Kryteria włączenia: Pacjenci z potwierdzoną chirurgicznie sporadyczną postacią PHPT i grupa kontrolna zostaną włączeni w następujący sposób; Grupa A: około 20 pacjentów z sporadyczną postacią nadczynności tarczycy Grupa B: około 10 pacjentów z prawidłową czynnością tarczycy w stanie eutyreozy, operowanych z powodu zaburzeń tarczycy, zapewni prawidłową tkankę przytarczyc służącą jako tkanka kontrolna.

Kryteria wykluczenia: Pacjenci z hiperplazją, niewydolnością nerek i mnogimi nowotworami wewnątrzwydzielniczymi zostaną wykluczeni.

Pobieranie próbek: Próbki tkanki przytarczyc zostaną pobrane natychmiast po operacji, szybko zamrożone i przechowywane w temperaturze -80oC do czasu użycia.

Metody oznaczania: Przedoperacyjne poziomy całkowitego wapnia w surowicy (zakres referencyjny, 8,6-10,2 mg/dl) zostanie określony przez automatyczny analizator (Modular P: Roche Diagnostics, Niemcy). Poziom wapnia w surowicy zostanie skorygowany o poziom albumin w surowicy. Nienaruszony PTH w surowicy (zakres referencyjny, 12-55 ng/l) i 25-hydroksywitamina D (11,1-42,9 ng/ml) będzie mierzona przy użyciu immunochemiluminescencji (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Niemcy).

1. Badanie ekspresji genów dla VDR i CaSR-

   1. Ekstrakcja RNA:

      Całkowity RNA zostanie wyekstrahowany z kriokonserwowanych próbek normalnej i gruczolakowatej tkanki przytarczyc przy użyciu odczynnika TRIZOL (Life Technologies, Inc.), zgodnie z instrukcjami dostawcy. Próbki zostaną wstępnie potraktowane DNazą i przechowywane w temperaturze -80oC do momentu użycia. cDNA zostanie wygenerowany z 3-4 mg RNA przez odwrotną transkryptazę z przypadkowymi heksamerami jako starterami.

   2. Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym:

   Poziomy mRNA VDR i CaSR zostaną oszacowane metodą Real-PCR (system Stratagene Robocycler Gradient 40) przy użyciu określonych sekwencji starterów i warunków PCR. Produkty PCR zostaną rozdzielone za pomocą elektroforezy na 6% żelu agarozowym; produkty zostaną następnie wybarwione bromkiem etydyny i zlokalizowane za pomocą fluorescencji w świetle UV. Do oceny intensywności prążków PCR można zastosować Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY).

2. Badanie ekspresji białka VDR, CaSR,PTH, cykliny D1, Ki67 i PCNA

   Immunohistochemia: przeciwciała monoklonalne zostaną użyte do barwienia immunologicznego białek VDR, CaSR, PTH, cykliny D1, Ki67 i PCNA na skrawkach parafinowych (Źródło-Pharmingen, USA). W każdym teście zostanie użyte przeciwciało drugorzędowe, kozie anty-mysie sprzężone z peroksydazą chrzanową (BD Biosciences, Pharmingen, USA), swoiste dla przeciwciał pierwszorzędowych. Do barwienia skrawków parafinowych zostanie zastosowana metoda pośredniej immunoperoksydazy. W tym teście nieskoniugowane pierwszorzędowe przeciwciało wiąże się z antygenem w próbce. Aby zlokalizować to przyłączenie, stosuje się swoiste przeciwciało drugorzędowe skoniugowane z peroksydazą, które wiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym. Następnie dodaje się substrat w celu zlokalizowania reakcji.

   Szkiełka zostaną następnie zbadane pod mikroskopem świetlnym. Barwienie zostanie ocenione jako negatywne (0), łagodne (+), umiarkowane (++) i zaznaczone (+++) w zależności od intensywności immunoreaktywności.

3. Porównanie profilu ekspresji białek-

   1. Ekstrakcja białek 100 mg tkanki zostanie zhomogenizowane z 0,5 ml zimnego (4°C) buforu do lizy. Białko zostanie oszacowane metodą Bicin Chronic Acid (BCA), a pozostałą część będzie przechowywać w temperaturze -80°C.

   2. Separacja pierwszego wymiaru (IEF) i drugiego wymiaru (SDS-PAGE) Zatężona próbka zostanie rozpuszczona w buforze do ponownego uwodnienia. Łącznie 125 - 200 µl zostanie nałożone na 7 cm pasek IPG (Amersham). Cykl IEF będzie przebiegał zgodnie z protokołem producenta.

      W przypadku drugiego wymiaru paski IPG będą równoważone przez 15 minut 6 ml buforu równoważącego. Każdy pasek IPG zostanie nałożony na 12% żel poliakryloamidowy i poddany elektroforezie (100 lub 200 V przez ~6 godzin). Po elektroforezie białka zostaną utrwalone i uwidocznione za pomocą barwników Coomassie i Silver.

   3. Analiza obrazu, trawienie trypsyną w żelu i analiza spektrometrii mas MALDI Wybarwione żele zostaną zeskanowane za pomocą densytometru GS-800 (Bio-Rad) przy użyciu oprogramowania PDQuest (Bio-Rad), a białka będące przedmiotem zainteresowania zostaną przeanalizowane za pomocą MALDI-TOFMS ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) w Instytucie Technologii Mikrobiologicznej (IMTech).

Białka będą identyfikowane poprzez pobieranie odcisków palców masy peptydów przy użyciu internetowej wyszukiwarki Mascot z pomocą peptydowych widm masowych.