Regulering af D-vitaminreceptor (VDR), Calcium Sensing Receptor (CaSR), Cyclin D1, Ki67 og Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) ved primær hyperparathyroidisme

Introduktion:

Primær hyperparathyroidisme (PHPT) er den tredjehyppigste endokrine lidelse, efter diabetes mellitus og skjoldbruskkirtellidelser, der overvejende rammer postmenopausale kvinder, med en forekomst på 1-5 ud af 1000 mennesker. Det kan forekomme i alle aldre, selvom unge sjældent er ramt. PHPT er karakteriseret ved hypersekretion af parathyroidhormon (PTH) og deraf følgende hypercalcæmi. De fleste tilfælde af PHPT (>85%) skyldes et solitært adenom i en af ​​biskjoldbruskkirtlerne. Multi-kirtel hyperplasi findes hos omkring 10-15% af patienterne, mens carcinom forekommer sjældent (1-2%).

Biskjoldbruskkirtlerne regulerer calciumhomeostase. De vigtigste målorganer for parathyreoideahormon (PTH) er knogler og nyrer. PTH øger knogleresorptionen for at mobilisere calcium ind i kredsløbet. I nyrerne øger PTH calcium reabsorption og øger fosfatudskillelse. PTH stimulerer også nyreproduktionen af ​​1α,25-dihydroxyvitamin D [1,25(OH)2D], som igen øger tarmens absorption af calcium. De fysiologiske virkninger af PTH er således at øge koncentrationen af ​​calcium i kredsløbet. Negativ feedback fra calcium og 1,25(OH)2D modulerer biskjoldbruskkirtlens funktion. Disse virkninger medieres via den calcium-sensing receptor (CaSR) udtrykt på parathyroid celleoverfladen. På samme måde virker 1,25(OH)2D gennem vitamin D-receptor (VDR) og undertrykker PTH-syntese og -sekretion. Således er PTH-sekretion tæt koblet til parathyreoideacellens omgivende calciumniveau.

Øget parathyroidcelleproliferation og nedsat calciummedieret kontrol af PTH-sekretionen er karakteristiske fund ved alle typer hyperparathyroidisme (1-4). Calcium via dets receptor, CaSR og 1,25(OH)2D-VDR-komplekset er de vigtigste regulatorer i denne henseende. Nedsat virkning af disse regulatorer ville stimulere parathyroidcellerne til at proliferere. Molekylære analyser har afsløret tilstedeværelsen af ​​tumorspecifikke DNA-omlejringer i en undergruppe af adenomer. I sådanne omlejringer kombineres 5'-PTH-genets regulatoriske region opstrøms for Cyclin D1-genet, hvilket resulterer i overekspression af cycliner, der kunne inducere proliferation ved at øge mitotisk hastighed. Faktisk blev Cyclin D1-overekspression først påvist hos en patient med parathyreoideaadenom (5).

Nedsat CaSR-genekspression findes i parathyroidlæsioner af både primær og sekundær hyperparathyroidisme (6-11). Der kunne ikke findes mutationer i CaSR-genet i parathyroidneoplasier (11,12). Lignende nuværende fund viser reduceret VDR-genekspression (8,13-15) og stemmer overens med undersøgelser af den tilsyneladende mangel på VDR-genmutationer i hyperparathyroidisme (16-18). Differentiel ekspression af VDR- og CaSR-gen er blevet rapporteret i nogle få parathyreoideaadenomer, men den nøjagtige mekanisme er ikke kendt. Disse observationer rejser muligheden for, at ændret ekspression af disse gener kan være relateret til patogenesen af ​​parathyroid adenomer.

MÅL: For at nå ovenstående mål vil følgende mål blive gennemført.

1. Sammenligning af ekspression af VDR- og CaSR-gener i parathyreoideaadenomer med normalt parathyroidvæv opnået under operation fra ikke-hyperparathyroidpatienter ved Real Time-PCR.
2. For at bekræfte ekspression af VDR, CaSR, PTH cyclin D1, Ki67 og PCNA i parathyroidceller ved immunhistokemi.
3. Sammenligning af proteinekspressionsprofil af parathyroid adenomer med normalt biskjoldbruskkirtelvæv ved proteomisk analyse.

MATERIALER OG METODER:

Emner:

Alle PHPT-patienter, der går til udendørs patientklinik på endokrinologisk og generel kirurgisk afdeling på Nehru Hospital, PGIMER, Chandigarh, vil blive inkluderet i denne undersøgelse med følgende inklusions- og eksklusionskriterier.

Inklusionskriterier: Patienter med kirurgisk verificeret sporadisk PHPT og kontroller vil blive inkluderet som følger; Gruppe A: ~ 20 sporadiske PHPT-patienter Gruppe B: ~10 normokalkæmiske euthyroidpatienter opereret for thyreoideasygdomme vil give normalt parathyreoideavæv til at fungere som kontrolvæv.

Eksklusionskriterier: Patienter med hyperplasi, nyresvigt og multipel endokrin neoplasi vil blive udelukket.

Prøveindsamling: Biskjoldbruskkirtlens vævsprøver vil blive indsamlet umiddelbart efter operationen, lynfryst og opbevaret ved -80oC indtil brug.

Analysemetoder: Præoperative niveauer af totalt serumcalcium (referenceområde 8,6-10,2) mg/dL) vil blive bestemt af auto-analysator (Modular P: Roche Diagnostics, Tyskland). Serumcalciumniveauet vil blive korrigeret med serumalbuminniveauet. Serumet intakt PTH (referenceområde, 12-55 ng/L) og 25-hydroxyvitamin D (11,1-42,9 ng/ml) vil blive målt ved hjælp af immunokemiluminiscens (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Tyskland).

1. Genekspressionsundersøgelse for VDR og CaSR-

   1. RNA ekstraktion:

      Totalt RNA vil blive ekstraheret fra de kryokonserverede normale og adenomatøse parathyroidvævsprøver ved at bruge TRIZOL-reagenset (Life Technologies, Inc.), i henhold til leverandørens instruktioner. Prøverne vil blive forbehandlet med DNase og opbevaret ved -80oC indtil brug. cDNA'et vil blive genereret fra de 3-4 mg RNA ved revers transkriptase med tilfældige hexamere som primere.

   2. Polymerasekædereaktion i realtid:

   mRNA-niveauerne af VDR og CaSR vil blive estimeret ved hjælp af Real-PCR (Stratagene Robocycler Gradient 40-system) under anvendelse af specifikke primersekvenser og PCR-betingelser. PCR-produkterne vil blive adskilt ved elektroforese på 6% agarosegel; produkterne vil derefter blive farvet med ethidiumbromid og lokaliseret ved fluorescens ved hjælp af UV-lys. Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) ville blive brugt til at evaluere båndintensiteterne af PCR-båndene.

2. Ekspressionsundersøgelse af VDR, CaSR,PTH, Cyclin D1, Ki67 og PCNA protein-

   Immunhistokemi: Monoklonale antistoffer vil blive brugt til immunfarvning af VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 og PCNA proteiner på paraffinsnit (Source-Pharmingen, USA). Sekundært antistof, gede-anti-mus peberrodsperoxidase konjugeret (BD Biosciences, Pharmingen, USA), specifikt for primære antistoffer, vil blive brugt i hver test. Indirekte immunoperoxidasemetode vil blive brugt til farvning af paraffinsnit. I denne analyse binder det ukonjugerede primære antistof til antigenet i prøven. For at lokalisere denne binding anvendes et peroxidasekonjugeret specifikt sekundært antistof, som binder til det primære antistof. Et substrat tilsættes derefter for at lokalisere reaktionen.

   Objektglassene vil derefter blive undersøgt under lysmikroskopet. Farvning vil blive klassificeret som negativ (0), mild (+), moderat (++) og markeret (+++) afhængigt af intensiteten af ​​immunreaktivitet.

3. Sammenligning af proteinekspressionsprofil-

   1. Ekstraktion af proteiner 100 mg væv homogeniseres med 0,5 ml kold (4°C) lyseringsbuffer. Protein vil blive estimeret ved Bicin Chronic Acid (BCA) metode og opbevare det resterende ved -80°C.

   2. First Dimension (IEF) og Second Dimension (SDS-PAGE) separation Den koncentrerede prøve vil blive solubiliseret i rehydreringsbuffer. I alt 125 - 200 µl vil blive fyldt på 7 cm IPG-strimmel (Amersham). IEF-kørsel vil være i overensstemmelse med producentens protokol.

      For anden dimension vil IPG-strimlerne blive ækvilibreret i 15 minutter med 6 ml ækvilibreringsbuffer. Hver IPG-strimmel sættes på 12 % polyacrylamidgel og elektroforeres (100 eller 200 V i ~6 timer). Efter elektroforese vil proteiner blive fikseret og visualiseret ved hjælp af Coomassie og Silver-farver.

   3. Billedanalyse, in-gel trypsinfordøjelse og MALDI massespektrometri analyse Farvede geler vil blive scannet med GS-800 densitometer (Bio-Rad) ved hjælp af PDQuest software (Bio-Rad), og proteinerne af interesse vil blive analyseret af MALDI-TOFMS ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) ved Institut for mikrobiel teknologi (IMTech).

Proteiner vil blive identificeret ved peptidmasse-fingeraftryk ved hjælp af Mascot webbaseret søgemaskine ved hjælp af peptidmassespektre.