D-vitamiinireseptorin (VDR), kalsiumia tunnistavan reseptorin (CaSR), sykliini D1:n, Ki67:n ja lisääntyvän solun ydinantigeenin (PCNA) säätely primaarisessa hyperparatyreoosissa

Esittely:

Primaarinen hyperparatyreoosi (PHPT) on diabeteksen ja kilpirauhasen vajaatoiminnan jälkeen kolmanneksi yleisin hormonaalinen sairaus, jota esiintyy pääasiassa postmenopausaalisilla naisilla, ja ilmaantuvuus on 1–5 henkilöä 1000:sta. Se voi ilmaantua missä iässä tahansa, vaikka nuoret sairastuvat harvoin. PHPT:lle on ominaista lisäkilpirauhashormonin (PTH) liikaeritys ja siitä johtuva hyperkalsemia. Suurin osa PHPT-tapauksista (> 85 %) johtuu yksittäisestä adenoomasta yhdessä lisäkilpirauhasista. Monen rauhasen liikakasvua havaitaan noin 10-15 %:lla potilaista, kun taas karsinoomaa esiintyy harvoin (1-2 %).

Lisäkilpirauhaset säätelevät kalsiumin homeostaasia. Lisäkilpirauhashormonin (PTH) tärkeimmät kohdeelimet ovat luu ja munuaiset. PTH lisää luun resorptiota kalsiumin mobilisoimiseksi verenkiertoon. Munuaisissa PTH tehostaa kalsiumin reabsorptiota ja lisää fosfaatin erittymistä. PTH stimuloi myös 1α,25-dihydroksi-D-vitamiinin [1,25(OH)2D] tuotantoa munuaisissa, mikä puolestaan ​​tehostaa kalsiumin imeytymistä suolistosta. Siten PTH:n fysiologiset vaikutukset ovat kalsiumin pitoisuuden lisääminen verenkierrossa. Kalsiumin ja 1,25(OH)2D:n negatiivinen palaute moduloi lisäkilpirauhasen toimintaa. Nämä vaikutukset välittyvät lisäkilpirauhasen solujen pinnalla ilmentyvän kalsiumia tunnistavan reseptorin (CaSR) kautta. Samoin 1,25(OH)2D toimii D-vitamiinireseptorin (VDR) kautta ja estää PTH-synteesiä ja -eritystä. Siten PTH-eritys on tiiviisti kytketty lisäkilpirauhassolun ympäröivään kalsiumtasoon.

Lisääntynyt lisäkilpirauhassolujen lisääntyminen ja heikentynyt kalsiumvälitteinen PTH-erityksen säätely ovat tyypillisiä löydöksiä kaikentyyppisissä hyperparatyreoosissa (1-4). Kalsium reseptorinsa, CaSR:n ja 1,25(OH)2D-VDR-kompleksin kautta ovat tärkeimmät säätelijät tässä suhteessa. Näiden säätelyaineiden heikentynyt vaikutus stimuloi lisäkilpirauhassoluja lisääntymään. Molekyylianalyysit ovat paljastaneet kasvainspesifisten DNA-uudelleenjärjestelyjen esiintymisen adenoomien osajoukossa. Tällaisissa uudelleenjärjestelyissä 5'-PTH-geenin säätelyalue yhdistyy ylävirtaan Cyclin D1 -geenistä, mikä johtaa sykliinien yli-ilmentymiseen, mikä voi indusoida proliferaatiota lisäämällä mitoottista nopeutta. Itse asiassa Cyclin D1 yliekspressio osoitettiin ensin potilaalla, jolla oli lisäkilpirauhasen adenooma (5).

Heikentynyttä CaSR-geenin ilmentymistä havaitaan sekä primaarisen että sekundaarisen hyperparatyreoosin lisäkilpirauhasleesioissa (6-11). CaSR-geenistä ei löytynyt mutaatioita lisäkilpirauhasen neoplasioissa (11,12). Samanlaiset nykyiset havainnot osoittavat vähentynyttä VDR-geenin ilmentymistä (8, 13-15) ja ovat yhtäpitäviä tutkimusten kanssa, jotka koskevat VDR-geenimutaatioiden ilmeistä puutetta hyperparatyreoosissa (16-18). VDR- ja CaSR-geenin erilaista ilmentymistä on raportoitu muutamissa lisäkilpirauhasen adenoomissa, mutta tarkkaa mekanismia ei tunneta. Nämä havainnot antavat mahdollisuuden, että näiden geenien muuttunut ilmentyminen voisi liittyä lisäkilpirauhasen adenoomien patogeneesiin.

TAVOITTEET: Yllä olevan tavoitteen saavuttamiseksi asetettaisiin seuraavat tavoitteet.

1. VDR- ja CaSR-geenien ilmentymisen vertailu lisäkilpirauhasen adenoomissa normaaliin lisäkilpirauhaskudokseen, joka on saatu leikkauksen aikana ei-hyperparatyroidisista potilaista Real Time-PCR:llä.
2. Vahvistaakseen VDR:n, CaSR:n, PTH-sykliini D1:n, Ki67:n ja PCNA:n ilmentymisen lisäkilpirauhassoluissa immunohistokemialla.
3. Lisäkilpirauhasen adenoomien proteiiniekspressioprofiilin vertailu normaaliin lisäkilpirauhaskudokseen proteomisella analyysillä.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT:

Aiheet:

Kaikki PHPT-potilaat, jotka osallistuvat Nehrun sairaalan PGIMERin, Chandigarhin endokrinologian ja yleiskirurgian osaston ulkoklinikalle, otetaan mukaan tähän tutkimukseen seuraavin mukaanotto- ja poissulkemiskriteerein.

Sisällyttämiskriteerit: Potilaat, joilla on kirurgisesti todennettu satunnainen PHPT ja kontrollit, otetaan mukaan seuraavasti; Ryhmä A: ~ 20 satunnaista PHPT-potilasta Ryhmä B: ~10 normokalseemista eutyroidista potilasta, jotka on leikattu kilpirauhasen häiriöiden vuoksi, tuottaa normaalia lisäkilpirauhaskudosta kontrollikudoksena.

Poissulkemiskriteerit: Potilaat, joilla on hyperplasia, munuaisten vajaatoiminta ja multippeli endokriininen neoplasia, suljetaan pois.

Näytteenotto: Lisäkilpirauhaskudosnäytteet otetaan välittömästi leikkauksen jälkeen, pakastetaan ja säilytetään -80 oC:ssa käyttöön asti.

Määritysmenetelmät: Seerumin kokonaiskalsiumin tasot ennen leikkausta (vertailualue, 8,6-10,2 mg/dL) määritetään automaattisella analysaattorilla (Modular P: Roche Diagnostics, Saksa). Seerumin kalsiumtaso korjataan seerumin albumiinitasolla. Seerumin koskematon PTH (vertailualue, 12-55 ng/l) ja 25-hydroksi-D-vitamiini (11,1-42,9) ng/ml) mitataan käyttämällä immunokemiluminisenssia (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Saksa).

1. Geeniekspressiotutkimus VDR:lle ja CaSR-

   1. RNA:n uutto:

      Kokonais-RNA uutetaan kylmäsäilytetyistä normaaleista ja adenomatoottisista lisäkilpirauhaskudosnäytteistä käyttämällä TRIZOL-reagenssia (Life Technologies, Inc.) myyjän ohjeiden mukaisesti. Näytteet esikäsitellään DNaasilla ja säilytetään -80 oC:ssa käyttöön asti. cDNA muodostetaan 3-4 mg:sta RNA:ta käänteiskopioijaentsyymin avulla käyttäen satunnaisia ​​heksameerejä alukkeina.

   2. Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio:

   VDR:n ja CaSR:n mRNA-tasot arvioidaan Real-PCR:llä (Stratagene Robocycler Gradient 40 -järjestelmä) käyttämällä spesifisiä alukesekvenssejä ja PCR-olosuhteita. PCR-tuotteet erotetaan elektroforeesilla 6 % agaroosigeelissä; tuotteet värjätään sitten etidiumbromidilla ja paikannetaan fluoresenssilla UV-valoa käyttäen. Bio Max 1D TM 1.5.1:tä (Kodak, Rochester, NY) käytettäisiin PCR-vyöhykkeiden vyöhykkeiden intensiteettien arvioimiseen.

2. VDR-, CaSR-, PTH-, Cyclin D1-, Ki67- ja PCNA-proteiinin ilmentymistutkimus

   Immunohistokemia: Monoklonaalisia vasta-aineita käytetään VDR-, CaSR-, PTH-, Cyclin D1-, Ki67- ja PCNA-proteiinien immunovärjäykseen parafiinileikkeillä (lähde-Pharmingen, USA). Jokaisessa testissä käytetään primäärisille vasta-aineille spesifistä sekundaarista vasta-ainetta, vuohen anti-hiiri piparjuuriperoksidaasilla konjugoitua (BD Biosciences, Pharmingen, USA). Parafiinileikkeiden värjäykseen käytetään epäsuoraa immunoperoksidaasimenetelmää. Tässä määrityksessä konjugoimaton primaarinen vasta-aine sitoutuu näytteessä olevaan antigeeniin. Tämän kiinnittymisen paikallistamiseksi käytetään peroksidaasilla konjugoitua spesifistä sekundaarista vasta-ainetta, joka sitoutuu primaariseen vasta-aineeseen. Sitten lisätään substraattia reaktion paikallistamiseksi.

   Objektilasit tutkitaan sitten valomikroskoopin alla. Värjäys luokitellaan negatiiviseksi (0), lieväksi (+), kohtalaiseksi (++) ja merkittäväksi (+++) immunoreaktiivisuuden intensiteetin mukaan.

3. Proteiinin ilmentymisprofiilin vertailu

   1. Proteiinien uuttaminen 100 mg kudosta homogenisoidaan 0,5 ml:lla kylmää (4 °C) lyysipuskuria. Proteiini arvioidaan Bicin krooninen happo (BCA) -menetelmällä ja säilytetään -80 °C:ssa.

   2. Ensimmäisen ulottuvuuden (IEF) ja toisen ulottuvuuden (SDS-PAGE) erottaminen Konsentroitu näyte liuotetaan rehydraatiopuskuriin. Yhteensä 125 - 200 µl ladataan 7 cm:n IPG-liuskaan (Amersham). IEF-ajo suoritetaan valmistajan protokollan mukaan.

      Toista mittaa varten IPG-liuskoja tasapainotetaan 15 minuutin ajan 6 ml:lla tasapainotuspuskuria. Jokainen IPG-nauha ladataan 12-prosenttiselle polyakryyliamidigeelille ja sille suoritetaan elektroforeesi (100 tai 200 V ~6 tunnin ajan). Elektroforeesin jälkeen proteiinit kiinnitetään ja ne visualisoidaan käyttämällä Coomassie- ja Silver-värjäyksiä.

   3. Kuva-analyysi, geelin sisäinen trypsiinidigestio ja MALDI-massaspektrometria-analyysi Värjätyt geelit skannataan GS-800-densitometrillä (Bio-Rad) käyttäen PDQuest-ohjelmistoa (Bio-Rad) ja kiinnostavat proteiinit analysoidaan MALDI-TOFMS:llä ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) mikrobiteknologian instituutissa (IMTech).

Proteiinit tunnistetaan peptidimassasormenjälkien avulla Mascot-verkkopohjaisella hakukoneella peptidimassaspektrien avulla.