A D-vitamin-receptor (VDR), a kalcium-érzékelő receptor (CaSR), a Cyclin D1, a Ki67 és a proliferáló sejtmagantigén (PCNA) szabályozása elsődleges hyperparathyreosisban

Bevezetés:

A primer hyperparathyreosis (PHPT) a harmadik leggyakoribb endokrin rendellenesség a diabetes mellitus és a pajzsmirigy-rendellenességek után, amely túlnyomórészt a posztmenopauzás nőket érinti, 1000 emberből 1-5-nél fordul elő. Bármely életkorban előfordulhat, bár a fiatalok ritkán érintik. A PHPT-t a mellékpajzsmirigy-hormon (PTH) túlzott elválasztása és az ebből eredő hiperkalcémia jellemzi. A PHPT legtöbb esete (>85%) az egyik mellékpajzsmirigyben lévő magányos adenoma eredménye. Több mirigy hiperplázia a betegek 10-15%-ában fordul elő, míg a carcinoma ritkán (1-2%) fordul elő.

A mellékpajzsmirigyek szabályozzák a kalcium homeosztázist. A parathormon (PTH) fő célszervei a csontok és a vesék. A PTH fokozza a csontfelszívódást, hogy mobilizálja a kalciumot a keringésbe. A vesében a PTH fokozza a kalcium reabszorpcióját és fokozza a foszfát kiválasztását. A PTH serkenti az 1α,25-dihidroxi-D-vitamin [1,25(OH)2D] vesében történő termelődését is, ami viszont fokozza a kalcium bélből történő felszívódását. Így a PTH élettani hatása a kalcium koncentrációjának növelése a keringésben. A kalciumból és az 1,25(OH)2D-ből származó negatív visszacsatolás modulálja a mellékpajzsmirigy működését. Ezeket a hatásokat a kalciumérzékelő receptor (CaSR) közvetíti, amely a mellékpajzsmirigy sejtfelszínén expresszálódik. Hasonlóképpen, az 1,25(OH)2D a D-vitamin receptoron (VDR) keresztül hat, és elnyomja a PTH szintézist és szekréciót. Így a PTH szekréció szorosan kapcsolódik a mellékpajzsmirigy sejt környezeti kalciumszintjéhez.

A fokozott mellékpajzsmirigy-sejtek proliferációja és a PTH-szekréció kalcium-mediált szabályozásának csökkenése a hyperparathyreosis minden típusára jellemző lelet (1-4). A kalcium receptorán, a CaSR-en és az 1,25(OH)2D-VDR komplexen keresztül a legfontosabb szabályozók ebből a szempontból. Ezeknek a szabályozóknak a csökkentett hatása serkentené a mellékpajzsmirigysejtek szaporodását. A molekuláris elemzések kimutatták a tumorspecifikus DNS-átrendeződések jelenlétét az adenomák egy részében. Az ilyen átrendeződésekben az 5' PTH gén szabályozó régió a Cyclin D1 géntől felfelé egyesül, ami a ciklinek túlzott expresszióját eredményezi, ami a mitotikus sebesség növelésével proliferációt indukálhat. Valójában a Cyclin D1 túlzott expresszióját először egy mellékpajzsmirigy-adenomában szenvedő betegnél mutatták ki (5).

Károsodott CaSR génexpressziót találtak mind az elsődleges, mind a másodlagos hyperparathyreosis mellékpajzsmirigy-lézióiban (6-11). Mellékpajzsmirigy neoplasiákban nem találtunk mutációt a CaSR génben (11,12). A jelenlegi hasonló eredmények csökkent VDR génexpressziót mutatnak (8, 13-15), és megegyeznek a VDR génmutációk nyilvánvaló hiányára vonatkozó vizsgálatokkal a hyperparathyreosisban (16-18). Néhány mellékpajzsmirigy adenomában a VDR és a CaSR gén eltérő expressziójáról számoltak be, de a pontos mechanizmus nem ismert. Ezek a megfigyelések felvetik annak lehetőségét, hogy e gének megváltozott expressziója összefüggésbe hozható a mellékpajzsmirigy adenomák patogenezisével.

CÉLKITŰZÉSEK: A fenti cél elérése érdekében a következő célkitűzéseket valósítjuk meg.

1. A VDR és CaSR gének expressziójának összehasonlítása mellékpajzsmirigy-adenomákban normál mellékpajzsmirigy-szövettel, amelyet nem hyperparathyreosisos betegek műtét során nyertünk Real Time-PCR-rel.
2. A VDR, CaSR, PTH ciklin D1, Ki67 és PCNA expressziójának megerősítése mellékpajzsmirigy sejtekben immunhisztokémiával.
3. A mellékpajzsmirigy adenomák fehérje expressziós profiljának összehasonlítása a normál mellékpajzsmirigy szövettel proteomikai elemzéssel.

ANYAGOK ÉS METÓDUSOK:

Tárgyak:

Az összes PHPT-beteg, aki részt vesz a Nehru Kórház Endokrinológiai és Általános Sebészeti Osztályának kültéri betegklinikáján, PGIMER, Chandigarh, a következő felvételi és kizárási kritériumokkal szerepel ebben a vizsgálatban.

Bevonási kritériumok: A sebészileg igazolt, szórványos PHPT-vel és kontrollokkal rendelkező betegek a következők szerint kerülnek felvételre; A csoport: ~ 20 sporadikus PHPT beteg B csoport: ~10 normocalcémiás euthyroid beteg, akiket pajzsmirigy-rendellenességek miatt operáltak, normális mellékpajzsmirigy szövetet biztosítanak kontrollszövetként.

Kizárási kritériumok: A hyperplasiában, veseelégtelenségben és többszörös endokrin neoplasiában szenvedő betegek kizárásra kerülnek.

Mintavétel: A mellékpajzsmirigy szövetmintákat közvetlenül a műtét után gyűjtik, azonnal lefagyasztják és felhasználásig -80 oC-on tárolják.

Vizsgálati módszerek: A teljes szérum kalcium műtét előtti szintje (referencia tartomány, 8,6-10,2 mg/dL) autoanalizátor határozza meg (Modular P: Roche Diagnostics, Németország). A szérum kalciumszintjét a szérum albuminszinttel korrigálják. A szérum intakt PTH (referencia tartomány, 12-55 ng/l) és 25-hidroxi-D-vitamin (11,1-42,9) ng/ml) immunochemilumineszcenciával (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Németország) mérjük.

1. VDR és CaSR génexpressziós vizsgálata

   1. RNS extrakció:

      A teljes RNS-t a TRIZOL-reagens (Life Technologies, Inc.) segítségével, az eladó utasításai szerint vonják ki a mélyhűtött normál és adenomás mellékpajzsmirigy-szövetmintákból. A mintákat DNázzal előkezeljük és felhasználásig -80oC-on tároljuk. A cDNS-t a 3-4 mg RNS-ből állítjuk elő reverz transzkriptázzal, primerként random hexamerekkel.

   2. Valós idejű polimeráz láncreakció:

   A VDR és a CaSR mRNS-szintjét Real-PCR-rel (Stratagene Robocycler Gradient 40 rendszer) becsüljük meg, specifikus primer szekvenciák és PCR körülmények alkalmazásával. A PCR-termékeket elektroforézissel választjuk el 6%-os agarózgélen; a termékeket ezután etídium-bromiddal megfestik, és UV-fény segítségével fluoreszcenciával határozzák meg. A PCR-sávok sávintenzitásának kiértékeléséhez a Bio Max 1D TM 1.5.1-et (Kodak, Rochester, NY) használjuk.

2. VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 és PCNA fehérje expressziós vizsgálata

   Immunhisztokémia: Monoklonális antitesteket használnak a VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 és PCNA fehérjék immunfestésére paraffin metszeteken (Forrás: Pharmingen, USA). Minden tesztben az elsődleges antitestekre specifikus másodlagos antitestet, kecske anti-egér torma-peroxidázzal konjugált (BD Biosciences, Pharmingen, USA) kell használni. A paraffin metszetek festésére indirekt immunperoxidáz módszert alkalmazunk. Ebben a vizsgálatban a nem konjugált primer antitest a mintában lévő antigénhez kötődik. Ennek a kötődésnek a lokalizálására egy peroxidázzal konjugált specifikus másodlagos antitestet használnak, amely kötődik az elsődleges antitesthez. Ezután szubsztrátot adunk hozzá a reakció lokalizálásához.

   A tárgylemezeket ezután fénymikroszkóp alatt megvizsgálják. Az immunreaktivitás intenzitásától függően a festődés negatív (0), enyhe (+), mérsékelt (++) és jelölt (+++) lesz.

3. A fehérje expressziós profil összehasonlítása

   1. A fehérjék kivonása 100 mg szövetet homogenizálunk 0,5 ml hideg (4°C) lízispufferrel. A fehérje mennyiségét Bicin krónikus sav (BCA) módszerrel becsülik meg, és a maradékot -80 °C-on tárolják.

   2. Első dimenziós (IEF) és második dimenziós (SDS-PAGE) elválasztás A koncentrált mintát rehidratációs pufferben szolubilizálják. Összesen 125-200 µl kerül egy 7 cm-es IPG csíkra (Amersham). Az IEF futtatása a gyártó protokollja szerint történik.

      A második dimenzióhoz az IPG csíkokat 15 percig 6 ml ekvilibrációs pufferrel egyensúlyozzuk ki. Minden egyes IPG csíkot 12%-os poliakrilamid gélre töltenek fel, és elektroforetizálnak (100 vagy 200 V ~ 6 órán keresztül). Az elektroforézis után a fehérjék fixálódnak, és Coomassie és Silver festékekkel láthatóvá válnak.

   3. Képelemzés, in-gél tripszin emésztés és MALDI tömegspektrometriás analízis A megfestett géleket GS-800 denzitométerrel (Bio-Rad) szkenneljük a PDQuest szoftver (Bio-Rad) segítségével, és a kérdéses fehérjéket a MALDI-TOFMS elemzi. Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) a Mikrobatechnológiai Intézetben (IMTech).

A fehérjék azonosítása peptid tömeg ujjlenyomattal történik a Mascot web alapú keresőmotor segítségével, peptid tömegspektrumok segítségével.