Регуляция рецептора витамина D (VDR), рецептора, чувствительного к кальцию (CaSR), циклина D1, Ki67 и ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) при первичном гиперпаратиреозе

Введение:

Первичный гиперпаратиреоз (ПГПТ) является третьим наиболее частым эндокринным заболеванием после сахарного диабета и заболеваний щитовидной железы, которым преимущественно страдают женщины в постменопаузе с частотой 1-5 на 1000 человек. Это может произойти в любом возрасте, хотя молодые люди редко страдают. PHPT характеризуется гиперсекрецией паратиреоидного гормона (PTH) и результирующей гиперкальциемией. Большинство случаев ПГПТ (>85%) возникают в результате солитарной аденомы в одной из паращитовидных желез. Гиперплазия нескольких желез обнаруживается примерно у 10-15% пациентов, в то время как карцинома встречается редко (1-2%).

Паращитовидные железы регулируют гомеостаз кальция. Основными органами-мишенями паратгормона (ПТГ) являются кости и почки. ПТГ увеличивает резорбцию кости, чтобы мобилизовать кальций в кровоток. В почках ПТГ усиливает реабсорбцию кальция и увеличивает экскрецию фосфатов. ПТГ также стимулирует выработку почками 1α,25-дигидроксивитамина D [1,25(OH)2D], что, в свою очередь, усиливает всасывание кальция в кишечнике. Таким образом, физиологические эффекты ПТГ заключаются в увеличении концентрации кальция в кровотоке. Отрицательная обратная связь от кальция и 1,25(OH)2D модулирует функцию паращитовидной железы. Эти эффекты опосредуются через кальций-чувствительный рецептор (CaSR), экспрессируемый на поверхности клеток паращитовидной железы. Точно так же 1,25(OH)2D действует через рецептор витамина D (VDR) и подавляет синтез и секрецию ПТГ. Таким образом, секреция ПТГ тесно связана с уровнем кальция в окружающей среде клеток паращитовидной железы.

Повышенная пролиферация клеток паращитовидной железы и сниженный кальций-опосредованный контроль секреции ПТГ являются характерными признаками всех типов гиперпаратиреоза (1-4). В этом отношении наиболее важными регуляторами являются кальций через его рецептор, CaSR и комплекс 1,25(OH)2D-VDR. Уменьшение действия этих регуляторов будет стимулировать пролиферацию клеток паращитовидной железы. Молекулярный анализ выявил наличие опухолеспецифических перестроек ДНК в подмножестве аденом. В таких перестройках регуляторная область 5'-гена PTH объединяется выше гена циклина D1, что приводит к сверхэкспрессии циклинов, которые могут индуцировать пролиферацию за счет увеличения скорости митоза. На самом деле сверхэкспрессия Cyclin D1 была впервые продемонстрирована у пациента с аденомой паращитовидной железы (5).

Нарушенная экспрессия гена CaSR обнаруживается при поражениях паращитовидных желез как при первичном, так и при вторичном гиперпаратиреозе (6-11). Мутации в гене CaSR при неоплазиях паращитовидных желез не обнаружены (11,12). Сходные настоящие результаты показывают сниженную экспрессию гена VDR (8, 13-15) и согласуются с исследованиями по очевидному отсутствию мутаций гена VDR при гиперпаратиреозе (16-18). Сообщалось о дифференциальной экспрессии генов VDR и CaSR в нескольких аденомах паращитовидной железы, но точный механизм неизвестен. Эти наблюдения повышают вероятность того, что измененная экспрессия этих генов может быть связана с патогенезом аденом паращитовидной железы.

ЗАДАЧИ: Для достижения вышеуказанной цели будут поставлены следующие задачи.

1. Сравнение экспрессии генов VDR и CaSR в аденомах паращитовидной железы с нормальной тканью паращитовидной железы, полученной во время операции у пациентов без гиперпаратиреоза, с помощью ПЦР в реальном времени.
2. Для подтверждения экспрессии VDR, CaSR, PTH cyclin D1, Ki67 и PCNA в клетках паращитовидной железы с помощью иммуногистохимии.
3. Сравнение профиля экспрессии белка аденом паращитовидной железы с нормальной тканью паращитовидной железы с помощью протеомного анализа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:

Предметы:

Все пациенты PHPT, посещающие открытую клинику эндокринологии и отделения общей хирургии больницы Неру, PGIMER, Чандигарх, будут включены в это исследование со следующими критериями включения и исключения.

Критерии включения: пациенты с хирургически подтвержденным спорадическим ПГПТ и контрольная группа будут включены следующим образом; Группа A: ~ 20 пациентов со спорадическим ПГПТ Группа B: ~ 10 пациентов с нормокальциемией и эутиреозом, оперированных по поводу заболеваний щитовидной железы, получат нормальную ткань паращитовидной железы для использования в качестве контрольной ткани.

Критерии исключения: будут исключены пациенты с гиперплазией, почечной недостаточностью и множественной эндокринной неоплазией.

Сбор образцов: Образцы ткани паращитовидной железы будут собраны сразу после операции, быстро заморожены и сохранены при -80°C до использования.

Методы анализа: Предоперационные уровни общего кальция в сыворотке (референтный диапазон 8,6–10,2). мг/дл) будет определяться автоматическим анализатором (Modular P: Roche Diagnostics, Германия). Уровень кальция в сыворотке будет корректироваться уровнем альбумина в сыворотке. Интактный ПТГ в сыворотке крови (референтный диапазон 12–55 нг/л) и 25-гидроксивитамин D (11,1–42,9 нг/мл) будут измерять с помощью иммунохемилюминесценции (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Германия).

1. Исследование экспрессии генов для VDR и CaSR-

   1. Экстракция РНК:

      Общая РНК будет извлечена из криоконсервированных образцов нормальной и аденоматозной паращитовидной железы с использованием реагента TRIZOL (Life Technologies, Inc.) в соответствии с инструкциями поставщика. Образцы предварительно обрабатывают ДНКазой и хранят при температуре -80°C до использования. кДНК будет генерироваться из 3-4 мг РНК с помощью обратной транскриптазы со случайными гексамерами в качестве праймеров.

   2. Полимеразная цепная реакция в реальном времени:

   Уровни мРНК VDR и CaSR будут оцениваться с помощью Real-PCR (система Stratagene Robocycler Gradient 40) с использованием конкретных последовательностей праймеров и условий ПЦР. Продукты ПЦР будут разделены электрофорезом на 6% агарозном геле; затем продукты будут окрашиваться бромистым этидием и обнаруживаться с помощью флуоресценции с использованием УФ-света. Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) будет использоваться для оценки интенсивностей полос ПЦР.

2. Исследование экспрессии белков VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 и PCNA.

   Иммуногистохимия: Моноклональные антитела будут использоваться для иммунного окрашивания белков VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 и PCNA на парафиновых срезах (Источник-Pharmingen, США). В каждом тесте будут использоваться вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена козла против мышиных антител (BD Biosciences, Pharmingen, США), специфичные к первичным антителам. Для окрашивания парафиновых срезов будет использоваться непрямой иммунопероксидазный метод. В этом анализе неконъюгированное первичное антитело связывается с антигеном в образце. Чтобы локализовать это присоединение, используется специфическое вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой, которое связывается с первичным антителом. Затем добавляют субстрат для локализации реакции.

   Затем слайды исследуют под световым микроскопом. Окрашивание будет оцениваться как отрицательное (0), слабое (+), умеренное (++) и выраженное (+++) в зависимости от интенсивности иммунореактивности.

3. Сравнение профиля экспрессии белка

   1. Экстракция белков. 100 мг ткани гомогенизируют с 0,5 мл холодного (4°C) лизирующего буфера. Белок будет оцениваться методом бициновой хронической кислоты (BCA), а остаток храниться при -80°C.

   2. Разделение по первому измерению (IEF) и второму измерению (SDS-PAGE) Концентрированный образец будет солюбилизирован в регидратационном буфере. Всего 125–200 мкл загружают на полоску IPG длиной 7 см (Amersham). Запуск IEF будет осуществляться в соответствии с протоколом производителя.

      Для второго измерения полоски IPG уравновешивают в течение 15 мин 6 мл уравновешивающего буфера. Каждую полоску IPG загружают в 12% полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу (100 или 200 В в течение ~ 6 часов). После электрофореза белки фиксируются и визуализируются с помощью красителей Кумасси и Сильвера.

   3. Анализ изображений, расщепление трипсином в геле и масс-спектрометрический анализ MALDI. Окрашенные гели будут сканироваться с помощью денситометра GS-800 (Bio-Rad) с использованием программного обеспечения PDQuest (Bio-Rad), а интересующие белки будут проанализированы с помощью MALDI-TOFMS ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) в Институте микробных технологий (IMTech).

Белки будут идентифицированы с помощью масс-спектрометрии пептидов с использованием веб-поиска Mascot с помощью масс-спектров пептидов.