原发性甲状旁腺功能亢进症中维生素 D 受体 (VDR)、钙敏感受体 (CaSR)、细胞周期蛋白 D1、Ki67 和增殖细胞核抗原 (PCNA) 的调节

介绍：

原发性甲状旁腺功能亢进症 (PHPT) 是第三大最常见的内分泌疾病，仅次于糖尿病和甲状腺疾病，主要影响绝经后妇女，每 1000 人中有 1 -5 人患病。 它可以发生在任何年龄，但年轻人很少受到影响。 PHPT 的特征是甲状旁腺激素 (PTH) 分泌过多和由此产生的高钙血症。 大多数 PHPT 病例 (>85%) 由甲状旁腺之一的孤立性腺瘤引起。 大约 10-15% 的患者发现多腺体增生，而很少发生癌变 (1-2%)。

甲状旁腺调节钙稳态。 甲状旁腺激素 (PTH) 的主要靶器官是骨骼和肾脏。 PTH 增加骨吸收以动员钙进入循环。 在肾脏中，PTH 增强钙的重吸收并增加磷酸盐的排泄。 PTH 还刺激肾脏产生 1α,25-二羟基维生素 D [1,25(OH)2D]，进而增强肠道对钙的吸收。 因此，PTH 的生理作用是增加循环中钙的浓度。 来自钙和 1,25(OH)2D 的负反馈调节甲状旁腺功能。 这些作用是通过甲状旁腺细胞表面表达的钙敏感受体 (CaSR) 介导的。 同样，1,25(OH)2D 通过维生素 D 受体 (VDR) 起作用并抑制 PTH 合成和分泌。 因此，PTH 分泌与甲状旁腺细胞的环境钙水平紧密相关。

甲状旁腺细胞增殖增加和钙介导的 PTH 分泌控制减少是所有类型甲状旁腺功能亢进症的特征发现 (1-4)。 在这方面，钙通过其受体、CaSR 和 1,25(OH)2D-VDR 复合物是最重要的调节剂。 这些调节剂作用的减弱会刺激甲状旁腺细胞增殖。 分子分析表明，在一部分腺瘤中存在肿瘤特异性 DNA 重排。 在这种重排中，5' PTH 基因调控区结合在细胞周期蛋白 D1 基因的上游，这导致细胞周期蛋白的过度表达，可通过增加有丝分裂率来诱导增殖。 事实上，Cyclin D1 过度表达首先在甲状旁腺腺瘤患者中得到证实 (5)。

在原发性和继发性甲状旁腺功能亢进症的甲状旁腺病变中发现受损的 CaSR 基因表达 (6-11)。 在甲状旁腺瘤形成的 CaSR 基因中未发现突变 (11,12)。 目前的类似发现显示 VDR 基因表达减少 (8,13-15)，并且与关于甲状旁腺功能亢进症中明显缺乏 VDR 基因突变的研究一致 (16-18)。 VDR和CaSR基因在少数甲状旁腺腺瘤中有差异表达的报道，但具体机制尚不清楚。 这些观察结果表明，这些基因的表达改变可能与甲状旁腺腺瘤的发病机制有关。

目标：为实现上述目标，将采取以下目标。

1. 通过实时 PCR 比较非甲状旁腺功能亢进患者手术期间获得的甲状旁腺腺瘤和正常甲状旁腺组织中 VDR 和 CaSR 基因的表达。
2. 通过免疫组织化学方法确定甲状旁腺细胞中VDR、CaSR、PTH cyclin D1、Ki67和PC​​NA的表达。
3. 通过蛋白质组学分析比较甲状旁腺腺瘤与正常甲状旁腺组织的蛋白质表达谱。

材料和方法：

科目：

所有参加昌迪加尔 PGIMER 尼赫鲁医院内分泌科和普通外科室外门诊的 PHPT 患者都将按照以下纳入和排除标准纳入本研究。

纳入标准：经手术证实为散发性 PHPT 的患者和对照组将按如下方式纳入； A 组：~ 20 名散发性 PHPT 患者 B 组：~ 10 名因甲状腺疾病而手术的正常血钙正常甲状腺患者将提供正常的甲状旁腺组织作为对照组织。

排除标准：患有增生、肾功能衰竭和多发性内分泌肿瘤的患者将被排除在外。

样本采集：甲状旁腺组织样本将在手术后立即采集，快速冷冻并储存在-80oC直至使用。

测定方法：术前血清总钙水平（参考范围，8.6-10.2 mg/dL) 将由自动分析仪 (Modular P: Roche Diagnostics, Germany) 测定。 血清钙水平将用血清白蛋白水平校正。 血清完整 PTH（参考范围，12-55 ng/L）和 25-羟基维生素 D（11.1-42.9 ng/ml) 将使用免疫化学发光 (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Germany) 进行测量。

1. VDR 和 CaSR- 的基因表达研究

   1. RNA提取：

      根据供应商的说明，将使用 TRIZOL 试剂（Life Technologies, Inc.）从冷冻保存的正常和腺瘤性甲状旁腺组织样品中提取总 RNA。 样品将用 DNase 预处理并储存在 -80oC 直至使用。 cDNA 将通过逆转录酶以随机六聚体作为引物从 3-4 mg RNA 中生成。

   2. 实时聚合酶链反应：

   VDR 和 CaSR 的 mRNA 水平将通过使用特定引物序列和 PCR 条件的 Real-PCR（Stratagene Robocycler Gradient 40 系统）进行评估。 PCR产物经6%琼脂糖凝胶电泳分离；然后将产品用溴化乙锭染色，并使用紫外光通过荧光定位。 Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) 将用于评估 PCR 条带的条带强度。

2. VDR、CaSR、PTH、Cyclin D1、Ki67和PC​​NA蛋白的表达研究-

   免疫组织化学：单克隆抗体将用于石蜡切片上的 VDR、CaSR、PTH、细胞周期蛋白 D1、Ki67 和 PCNA 蛋白的免疫染色（来源 - Pharmingen，美国）。 二级抗体，山羊抗小鼠辣根过氧化物酶偶联物（BD Biosciences，Pharmingen，美国），对一级抗体具有特异性，将用于每次测试。 石蜡切片染色采用间接免疫过氧化物酶法。 在此测定中，未偶联的一抗与标本中的抗原结合。 为了定位这种附着，使用与一抗结合的过氧化物酶偶联的特异性二抗。 然后添加底物以使反应局部化。

   然后将在光学显微镜下检查载玻片。 根据免疫反应的强度，染色将分级为阴性 (0)、轻度 (+)、中度 (++) 和显着 (+++)。

3. 蛋白质表达谱的比较-

   1. 蛋白质的提取 100mg 组织将用 0.5ml 冷 (4°C) 裂解缓冲液匀化。 将通过 Bicin 慢性酸 (BCA) 方法估计蛋白质并将剩余的储存在-80°C。

   2. 第一维 (IEF) 和第二维 (SDS-PAGE) 分离浓缩的样品将溶解在再水化缓冲液中。 总共 125 - 200 µl 将被加载到 7 cm IPG 胶条 (Amersham) 上。 IEF 运行将根据制造商的协议进行。

      对于第二维，IPG 胶条将用 6 ml 平衡缓冲液平衡 15 分钟。 每个 IPG 条将加载到 12% 的聚丙烯酰胺凝胶上并进行电泳（100 或 200 V 约 6 小时）。 电泳后，蛋白质将被固定并使用考马斯和银染进行可视化。

   3. 图像分析、凝胶内胰蛋白酶消化和 MALDI 质谱分析染色凝胶将使用 PDQuest 软件（Bio-Rad）用 GS-800 光密度计（Bio-Rad）扫描，感兴趣的蛋白质将通过 MALDI-TOFMS（微生物技术研究所 (IMTech) 的 Voyager DE-PRO，Applied Biosystems）。

将在肽质谱的帮助下使用基于 Mascot 网络的搜索引擎通过肽质量指纹识别来识别蛋白质。