Régulation du récepteur de la vitamine D (VDR), du récepteur sensible au calcium (CaSR), de la cycline D1, du Ki67 et de l'antigène nucléaire des cellules proliférantes (PCNA) dans l'hyperparathyroïdie primaire

Introduction:

L'hyperparathyroïdie primaire (PHPT) est le troisième trouble endocrinien le plus fréquent, après le diabète sucré et les troubles thyroïdiens, qui touche principalement les femmes ménopausées, avec une incidence de 1 à 5 personnes sur 1000. Elle peut survenir à tout âge bien que les jeunes soient rarement touchés. La PHPT est caractérisée par une hypersécrétion d'hormone parathyroïdienne (PTH) et une hypercalcémie qui en résulte. La plupart des cas de PHPT (> 85 %) résultent d'un adénome solitaire dans l'une des glandes parathyroïdes. L'hyperplasie multi-glandulaire est présente chez environ 10 à 15 % des patients, tandis que le carcinome survient rarement (1 à 2 %).

Les glandes parathyroïdes régulent l'homéostasie du calcium. Les principaux organes cibles de l'hormone parathyroïdienne (PTH) sont les os et les reins. La PTH augmente la résorption osseuse pour mobiliser le calcium dans la circulation. Dans le rein, la PTH améliore la réabsorption du calcium et augmente l'excrétion du phosphate. La PTH stimule également la production rénale de 1α,25-dihydroxyvitamine D [1,25(OH)2D], qui à son tour améliore l'absorption intestinale du calcium. Ainsi, les effets physiologiques de la PTH sont d'augmenter la concentration de calcium dans la circulation. La rétroaction négative du calcium et du 1,25(OH)2D module la fonction parathyroïdienne. Ces effets sont médiés par le récepteur sensible au calcium (CaSR) exprimé à la surface des cellules parathyroïdiennes. De même, le 1,25(OH)2D agit par l'intermédiaire du récepteur de la vitamine D (VDR) et supprime la synthèse et la sécrétion de PTH . Ainsi, la sécrétion de PTH est étroitement couplée au taux de calcium ambiant de la cellule parathyroïde.

Une prolifération accrue des cellules parathyroïdiennes et une diminution du contrôle calcique de la sécrétion de PTH sont des résultats caractéristiques de tous les types d'hyperparathyroïdie (1-4). Le calcium via son récepteur, le CaSR et le complexe 1,25(OH)2D-VDR sont les régulateurs les plus importants à cet égard. Une diminution des actions de ces régulateurs stimulerait la prolifération des cellules parathyroïdiennes. Des analyses moléculaires ont révélé la présence de réarrangements d'ADN spécifiques à la tumeur dans un sous-ensemble d'adénomes. Dans de tels réarrangements, la région régulatrice du gène 5' PTH se combine en amont du gène de la cycline D1, ce qui entraîne une surexpression des cyclines qui pourraient induire une prolifération en augmentant le taux de mitose. En fait, la surexpression de la cycline D1 a été démontrée pour la première fois chez un patient atteint d'un adénome parathyroïdien (5).

L'expression altérée du gène CaSR se trouve dans les lésions parathyroïdiennes de l'hyperparathyroïdie primaire et secondaire (6-11). Aucune mutation n'a pu être trouvée dans le gène CaSR dans les néoplasies parathyroïdiennes (11,12). Des découvertes actuelles similaires montrent une expression réduite du gène VDR (8, 13-15) et concordent avec les études sur l'absence apparente de mutations du gène VDR dans l'hyperparathyroïdie (16-18). L'expression différentielle des gènes VDR et CaSR a été rapportée dans quelques adénomes parathyroïdiens, mais le mécanisme exact n'est pas connu. Ces observations soulèvent la possibilité que l'expression altérée de ces gènes puisse être liée à la pathogenèse des adénomes parathyroïdiens.

OBJECTIFS : Pour atteindre le but ci-dessus, les objectifs suivants seraient entrepris.

1. Comparaison de l'expression des gènes VDR et CaSR dans les adénomes parathyroïdiens avec du tissu parathyroïdien normal obtenu lors d'une intervention chirurgicale chez des patients non hyperparathyroïdiens par PCR en temps réel.
2. Confirmer l'expression de VDR, CaSR, PTH cycline D1, Ki67 et PCNA dans les cellules parathyroïdiennes par immunohistochimie.
3. Comparaison du profil d'expression protéique des adénomes parathyroïdiens avec le tissu parathyroïdien normal par analyse protéomique.

MATÉRIELS ET MÉTHODES:

Sujets:

Tous les patients PHPT fréquentant la clinique extérieure des patients du département d'endocrinologie et de chirurgie générale de l'hôpital Nehru, PGIMER, Chandigarh seront inclus dans cette étude avec les critères d'inclusion et d'exclusion suivants.

Critères d'inclusion : les patients atteints de PHPT sporadique vérifié chirurgicalement et les témoins seront inclus comme suit ; Groupe A : ~ 20 patients PHPT sporadiques Groupe B : ~ 10 patients euthyroïdiens normocalcémiques opérés pour des troubles thyroïdiens fourniront du tissu parathyroïdien normal pour servir de tissu de contrôle.

Critères d'exclusion : les patients atteints d'hyperplasie, d'insuffisance rénale et de néoplasie endocrinienne multiple seront exclus.

Prélèvement d'échantillons : des échantillons de tissu parathyroïdien seront prélevés immédiatement après la chirurgie, congelés et stockés à -80 oC jusqu'à leur utilisation.

Méthodes de dosage : niveaux préopératoires de calcium sérique total (intervalle de référence, 8,6-10,2 mg/dL) sera déterminée par un auto-analyseur (Modular P : Roche Diagnostics, Allemagne). Le niveau de calcium sérique sera corrigé avec le niveau d'albumine sérique. La PTH sérique intacte (gamme de référence, 12-55 ng/L) et la 25-hydroxyvitamine D (11,1-42,9 ng/ml) sera mesuré par immunochimiluminescence (ELECSYS-2010 : Roche Diagnostics, Allemagne).

1. Étude de l'expression génique pour VDR et CaSR-

   1. Extraction d'ARN :

      L'ARN total sera extrait des échantillons de tissus parathyroïdiens normaux et adénomateux cryoconservés à l'aide du réactif TRIZOL (Life Technologies, Inc.), conformément aux instructions du fournisseur. Les échantillons seront prétraités avec de la DNase et stockés à -80oC jusqu'à leur utilisation. L'ADNc sera généré à partir des 3-4 mg d'ARN par transcriptase inverse avec des hexamères aléatoires comme amorces.

   2. Réaction en chaîne par polymérase en temps réel :

   Les niveaux d'ARNm de VDR et de CaSR seront estimés par Real-PCR (système Stratagene Robocycler Gradient 40) en utilisant des séquences d'amorces et des conditions de PCR spécifiques. Les produits de PCR seront séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 6% ; les produits seront ensuite colorés au bromure d'éthidium et repérés par fluorescence sous lumière UV. Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) serait utilisé pour évaluer les intensités de bande des bandes PCR.

2. Étude de l'expression des protéines VDR, CaSR, PTH, Cycline D1, Ki67 et PCNA -

   Immunohistochimie : Des anticorps monoclonaux seront utilisés pour l'immunomarquage des protéines VDR, CaSR, PTH, Cycline D1, Ki67 et PCNA sur coupes en paraffine (Source-Pharmingen, USA). Un anticorps secondaire, chèvre anti-souris de raifort peroxydase conjugué (BD Biosciences, Pharmingen, USA), spécifique des anticorps primaires sera utilisé dans chaque test. La méthode d'immunoperoxydase indirecte sera utilisée pour la coloration des coupes en paraffine. Dans ce test, l'anticorps primaire non conjugué se lie à l'antigène dans l'échantillon. Pour localiser cette fixation, on utilise un anticorps secondaire spécifique conjugué à la peroxydase qui se lie à l'anticorps primaire. Un substrat est ensuite ajouté pour localiser la réaction.

   Les lames seront ensuite examinées au microscope optique. La coloration sera classée comme négative (0), légère (+), modérée (++) et marquée (+++) en fonction de l'intensité de l'immunoréactivité.

3. Comparaison du profil d'expression des protéines-

   1. Extraction des protéines 100 mg de tissu seront homogénéisés avec 0,5 ml de tampon de lyse froid (4°C). Les protéines seront estimées par la méthode de l'acide chronique à la bicine (BCA) et le reste sera conservé à -80 °C.

   2. Séparation de première dimension (IEF) et de deuxième dimension (SDS-PAGE) L'échantillon concentré sera solubilisé dans un tampon de réhydratation. Un total de 125 à 200 µl sera chargé sur une bande IPG de 7 cm (Amersham). L'exécution IEF sera conforme au protocole du fabricant.

      Pour la deuxième dimension, les bandes IPG seront équilibrées pendant 15 min avec 6 ml de tampon d'équilibrage. Chaque bande IPG sera chargée sur un gel de polyacrylamide à 12 % et soumise à une électrophorèse (100 ou 200 V pendant ~ 6 h). Après l'électrophorèse, les protéines seront fixées et visualisées à l'aide des colorations Coomassie et Silver.

   3. Analyse d'image, digestion de trypsine en gel et analyse par spectrométrie de masse MALDI Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) à l'Institut de technologie microbienne (IMTech).

Les protéines seront identifiées par empreinte de masse peptidique à l'aide du moteur de recherche Web Mascot à l'aide de spectres de masse peptidiques.