원발성 부갑상선기능항진증에서 비타민 D 수용체(VDR), 칼슘 감지 수용체(CaSR), 사이클린 D1, Ki67 및 세포 핵 항원 증식(PCNA)의 조절

소개:

원발성 부갑상샘기능항진증(PHPT)은 당뇨병과 갑상선 질환 다음으로 세 번째로 흔한 내분비 장애로 폐경 후 여성에게 주로 영향을 미치며 1000명당 1~5명의 발병률을 보입니다. 젊은 사람들은 거의 영향을 받지 않지만 모든 연령대에서 발생할 수 있습니다. PHPT는 부갑상선 호르몬(PTH)의 과분비 및 그에 따른 고칼슘혈증을 특징으로 합니다. 대부분의 PHPT 사례(>85%)는 부갑상선 중 하나의 단독 선종에서 발생합니다. 다발성 과형성은 환자의 약 10-15%에서 발견되는 반면 암종은 드물게(1-2%) 발생합니다.

부갑상선은 칼슘 항상성을 조절합니다. 부갑상선 호르몬(PTH)의 주요 표적 기관은 뼈와 신장입니다. PTH는 뼈 재흡수를 증가시켜 칼슘을 순환계로 동원합니다. 신장에서 PTH는 칼슘 재흡수를 촉진하고 인산염 배설을 증가시킵니다. PTH는 또한 1α,25-dihydroxyvitamin D[1,25(OH)2D]의 신장 생성을 자극하여 칼슘의 장 흡수를 향상시킵니다. 따라서 PTH의 생리적 효과는 순환계의 칼슘 농도를 증가시키는 것입니다. 칼슘과 1,25(OH)2D의 음성 피드백은 부갑상선 기능을 조절합니다. 이러한 효과는 부갑상선 세포 표면에서 발현되는 칼슘 감지 수용체(CaSR)를 통해 매개됩니다. 마찬가지로 1,25(OH)2D는 비타민 D 수용체(VDR)를 통해 작용하여 PTH 합성 및 분비를 억제합니다. 따라서 PTH 분비는 부갑상선 세포의 주변 칼슘 농도와 밀접하게 연결되어 있습니다.

증가된 부갑상선 세포 증식 및 감소된 칼슘-매개된 PTH 분비 조절은 모든 유형의 부갑상선기능항진증에서 특징적인 소견이다(1-4). 수용체를 통한 칼슘, CaSR 및 1,25(OH)2D-VDR 복합체는 이와 관련하여 가장 중요한 조절자입니다. 이러한 조절자의 작용이 감소하면 부갑상선 세포가 증식하도록 자극됩니다. 분자 분석은 선종의 부분집합에서 종양 특이적 DNA 재배열의 존재를 밝혀냈습니다. 이러한 재배열에서 5' PTH 유전자 조절 영역은 Cyclin D1 유전자의 업스트림을 결합하여 유사분열 속도를 증가시켜 증식을 유도할 수 있는 사이클린의 과발현을 초래합니다. 실제로 Cyclin D1의 과발현은 부갑상선 선종 환자에게서 처음으로 입증되었습니다(5).

손상된 CaSR 유전자 발현은 1차 및 2차 부갑상샘기능항진증 모두의 부갑상샘 병변에서 발견됩니다(6-11). 부갑상선 신생물의 CaSR 유전자에서 돌연변이가 발견되지 않았습니다(11,12). 유사한 현재 발견은 감소된 VDR 유전자 발현을 나타내며(8,13-15), 부갑상선기능항진증에서 VDR 유전자 돌연변이의 명백한 부족에 대한 연구와 일치합니다(16-18). 몇몇 부갑상선종에서 VDR과 CaSR 유전자의 차등 발현이 보고된 바 있으나 정확한 기전은 알려져 있지 않다. 이러한 관찰은 이러한 유전자의 변경된 발현이 부갑상선 선종의 병인과 관련될 수 있는 가능성을 높입니다.

목표: 위의 목표를 달성하기 위해 다음 목표를 수행합니다.

1. Real Time-PCR을 이용한 부갑상선기능항진증 환자가 아닌 환자로부터 수술 중 얻은 정상 부갑상선 조직을 가진 부갑상선 선종에서 VDR 및 CaSR 유전자의 발현 비교.
2. 면역조직화학에 의해 부갑상선 세포에서 VDR, CaSR, PTH cyclin D1, Ki67 및 PCNA의 발현을 확인하기 위해.
3. proteomic 분석에 의한 정상 부갑상선 조직과 부갑상선 선종의 단백질 발현 프로파일 비교.

재료 및 방법:

주제:

Nehru Hospital, PGIMER, Chandigarh의 내분비학 및 일반외과의 야외 환자 클리닉에 참석하는 모든 PHPT 환자는 다음 포함 및 제외 기준에 따라 이 연구에 포함됩니다.

포함 기준: 외과적으로 확인된 산발성 PHPT 및 대조군 환자는 다음과 같이 포함됩니다. 그룹 A: ~ 20명의 산발성 PHPT 환자 그룹 B: ~10명의 정상칼슘혈증 정상 갑상선 환자가 갑상선 질환에 대해 수술을 받고 정상적인 부갑상선 조직을 대조 조직으로 제공합니다.

제외 기준: 과형성, 신부전 및 다발성 내분비 종양이 있는 환자는 제외됩니다.

시료 채취: 부갑상선 조직 시료는 수술 직후 채취하여 급속 냉동하여 사용할 때까지 -80oC에서 보관합니다.

분석 방법: 총 혈청 칼슘의 수술 전 수준(참조 범위, 8.6-10.2 mg/dL)는 자동 분석기(Modular P: Roche Diagnostics, 독일)에 의해 결정됩니다. 혈청 칼슘 수치는 혈청 알부민 수치로 보정됩니다. 혈청 온전한 PTH(참조 범위, 12-55ng/L) 및 25-하이드록시비타민 D(11.1-42.9 ng/ml)는 면역화학발광(ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Germany)을 사용하여 측정할 것이다.

1. VDR 및 CaSR-에 대한 유전자 발현 연구

   1. RNA 추출:

      공급업체의 지침에 따라 TRIZOL 시약(Life Technologies, Inc.)을 사용하여 동결 보존된 정상 및 선종성 부갑상선 조직 샘플에서 총 RNA를 추출합니다. 샘플은 DNase로 전처리되고 사용할 때까지 -80oC에서 보관됩니다. cDNA는 무작위 헥사머를 프라이머로 사용하여 역전사효소에 의해 RNA 3-4mg에서 생성됩니다.

   2. 실시간 중합효소 연쇄 반응:

   VDR 및 CaSR의 mRNA 수준은 특정 프라이머 서열 및 PCR 조건을 사용하여 Real-PCR(Stratagene Robocycler Gradient 40 시스템)에 의해 추정됩니다. PCR 산물은 6% 아가로스 젤에서 전기영동으로 분리됩니다. 그런 다음 제품은 ethidium bromide로 염색되고 UV 광선을 사용하여 형광으로 위치를 찾습니다. Bio Max 1D TM 1.5.1(Kodak, Rochester, NY)을 사용하여 PCR 밴드의 밴드 강도를 평가합니다.

2. VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 및 PCNA 단백질의 발현 연구 -

   면역조직화학: 단클론 항체는 파라핀 섹션에서 VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 및 PCNA 단백질의 면역염색에 사용될 것입니다(Source-Pharmingen, USA). 1차 항체에 특이적인 2차 항체, 염소 항-마우스 고추냉이 과산화효소 접합체(BD Biosciences, Pharmingen, USA)가 각 테스트에 사용됩니다. 간접 면역과산화효소 방법은 파라핀 섹션의 염색에 사용됩니다. 이 분석에서는 접합되지 않은 1차 항체가 검체의 항원에 결합합니다. 이 부착물을 국소화하기 위해 1차 항체에 결합하는 퍼옥시다제 접합된 특정 2차 항체가 사용됩니다. 기질은 반응을 국소화하기 위해 추가됩니다.

   그런 다음 슬라이드를 광학 현미경으로 검사합니다. 염색은 면역 반응의 강도에 따라 음성(0), 약함(+), 보통(++) 및 표시됨(+++)으로 등급이 매겨집니다.

3. 단백질 발현 프로파일 비교-

   1. 단백질 추출 조직 100mg을 차가운(4°C) 용해 완충액 0.5ml로 균질화합니다. 단백질은 BCA(Bicin chronic Acid) 방법으로 추정하고 나머지는 -80°C에 보관합니다.

   2. 1차원(IEF) 및 2차원(SDS-PAGE) 분리 농축된 시료는 재수화 완충액에 용해됩니다. 총 125~200µl가 7cm IPG 스트립(Amersham)에 로드됩니다. IEF 실행은 제조업체의 프로토콜에 따릅니다.

      2차원의 경우 IPG 스트립은 6ml 평형 완충액으로 15분 동안 평형화됩니다. 각 IPG 스트립은 12% 폴리아크릴아미드 겔에 로드되고 전기영동됩니다(~6시간 동안 100 또는 200V). 전기영동 후 단백질이 고정되고 Coomassie 및 Silver 염색을 사용하여 시각화됩니다.

   3. 이미지 분석, In-gel 트립신 분해 및 MALDI 질량분석법 PDQuest 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 염색된 겔을 GS-800 밀도계(Bio-Rad)로 스캔하고 관심 있는 단백질을 MALDI-TOFMS( 미생물 기술 연구소(IMTech)의 Voyager DE-PRO, Applied Biosystems).

단백질은 펩타이드 질량 스펙트럼의 도움으로 Mascot 웹 기반 검색 엔진을 사용하여 펩타이드 질량 지문으로 식별됩니다.