Regulering av vitamin D-reseptor (VDR), kalsiumsensorreseptor (CaSR), Cyclin D1, Ki67 og prolifererende cellekjerneantigen (PCNA) ved primær hyperparatyreoidisme

Introduksjon:

Primær hyperparatyreoidisme (PHPT) er den tredje hyppigste endokrine lidelsen, etter diabetes mellitus og skjoldbruskkjertellidelser, som hovedsakelig rammer postmenopausale kvinner, med en forekomst på 1-5 av 1000 personer. Det kan forekomme i alle aldre, selv om unge mennesker sjelden er rammet. PHPT er preget av hypersekresjon av parathyroidhormon (PTH) og resulterende hyperkalsemi. De fleste tilfeller av PHPT (>85%) skyldes et ensomt adenom i en av biskjoldbruskkjertlene. Multikjertelhyperplasi er funnet hos ca 10-15 % av pasientene mens karsinom forekommer sjelden (1-2 %).

Biskjoldbruskkjertlene regulerer kalsiumhomeostase. De viktigste målorganene for parathyroidhormon (PTH) er bein og nyrer. PTH øker benresorpsjonen for å mobilisere kalsium inn i sirkulasjonen. I nyrene øker PTH kalsiumreabsorpsjonen og øker utskillelsen av fosfat. PTH stimulerer også nyreproduksjonen av 1α,25-dihydroksyvitamin D [1,25(OH)2D], som igjen forbedrer tarmens absorpsjon av kalsium. Dermed er de fysiologiske effektene av PTH å øke konsentrasjonen av kalsium i sirkulasjonen. Negativ tilbakemelding fra kalsium og 1,25(OH)2D modulerer biskjoldbruskkjertelfunksjonen. Disse effektene formidles via den kalsiumfølende reseptoren (CaSR) uttrykt på biskjoldbruskkjertelens celleoverflate. På samme måte virker 1,25(OH)2D gjennom vitamin D-reseptor (VDR) og undertrykker PTH-syntese og sekresjon. Dermed er PTH-sekresjon tett koblet til biskjoldbruskkjertelcellens omgivende kalsiumnivå.

Økt parathyreoideacelleproliferasjon og redusert kalsiummediert kontroll av PTH-sekresjonen er karakteristiske funn ved alle typer hyperparatyreoidisme (1-4). Kalsium via sin reseptor, CaSR og 1,25(OH)2D-VDR-komplekset er de viktigste regulatorene i denne forbindelse. Redusert virkning av disse regulatorene vil stimulere biskjoldbruskkjertelcellene til å spre seg. Molekylære analyser har avslørt tilstedeværelsen av tumorspesifikke DNA-omorganiseringer i en undergruppe av adenomer. I slike omorganiseringer kombineres 5'-PTH-genets regulatoriske region oppstrøms for Cyclin D1-genet, noe som resulterer i overekspresjon av cykliner som kan indusere spredning ved å øke mitotisk hastighet. Faktisk ble Cyclin D1-overekspresjon først påvist hos en pasient med parathyreoideaadenom (5).

Nedsatt CaSR-genekspresjon finnes i parathyroidlesjoner av både primær og sekundær hyperparatyreoidisme (6-11). Det ble ikke funnet mutasjoner i CaSR-genet ved parathyroidneoplasier (11,12). Lignende nåværende funn viser redusert VDR-genekspresjon (8,13-15) og stemmer overens med studier på den tilsynelatende mangelen på VDR-genmutasjoner ved hyperparatyreoidisme (16-18). Differensiell ekspresjon av VDR- og CaSR-gen er rapportert i noen få parathyreoideaadenomer, men nøyaktig mekanisme er ikke kjent. Disse observasjonene øker muligheten for at endret uttrykk for disse genene kan være relatert til patogenesen av parathyroid adenomer.

MÅL: For å nå målene ovenfor vil følgende mål bli tatt.

1. Sammenligning av ekspresjon av VDR- og CaSR-gener i biskjoldbruskkjerteladenomer med normalt biskjoldbruskkjertelvev oppnådd under kirurgi fra ikke-hyperparatyreoideapasienter ved Real Time-PCR.
2. For å bekrefte uttrykk av VDR, CaSR, PTH cyclin D1, Ki67 og PCNA i parathyroidceller ved immunhistokjemi.
3. Sammenligning av proteinekspresjonsprofil av parathyreoideaadenomer med normalt parathyroidvev ved proteomisk analyse.

MATERIALER OG METODER:

Emner:

Alle PHPT-pasienter som går på utendørs pasientklinikk ved endokrinologisk og generell kirurgisk avdeling ved Nehru Hospital, PGIMER, Chandigarh vil bli inkludert i denne studien med følgende inklusjons- og eksklusjonskriterier.

Inklusjonskriterier: Pasienter med kirurgisk verifisert sporadisk PHPT og kontroller vil bli inkludert som følger; Gruppe A: ~ 20 sporadiske PHPT-pasienter Gruppe B: ~10 normokalsemiske euthyroidpasienter operert for skjoldbruskkjertelforstyrrelser vil gi normalt biskjoldbruskkjertelvev for å tjene som kontrollvev.

Eksklusjonskriterier: Pasienter med hyperplasi, nyresvikt og multippel endokrin neoplasi vil bli ekskludert.

Prøvetaking: Parathyreoidea vevsprøver vil bli tatt umiddelbart etter operasjonen, hurtigfryst og lagret ved -80oC frem til bruk.

Analysemetoder: Preoperative nivåer av totalt serumkalsium (referanseområde, 8,6-10,2 mg/dL) vil bli bestemt av autoanalysator (Modular P: Roche Diagnostics, Tyskland). Serumkalsiumnivået vil bli korrigert med serumalbuminnivået. Serumet intakt PTH (referanseområde, 12-55 ng/L) og 25-hydroksyvitamin D (11,1-42,9 ng/ml) vil bli målt ved hjelp av immunokjemiluminiscens (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Tyskland).

1. Genekspresjonsstudie for VDR og CaSR-

   1. RNA-ekstraksjon:

      Totalt RNA vil bli ekstrahert fra kryokonserverte normale og adenomatøse parathyroidvevsprøver ved å bruke TRIZOL-reagensen (Life Technologies, Inc.), i henhold til leverandørens instruksjoner. Prøvene vil bli forbehandlet med DNase og lagret ved -80oC frem til bruk. cDNA vil bli generert fra 3-4 mg RNA ved revers transkriptase med tilfeldige heksamere som primere.

   2. Polymerasekjedereaksjon i sanntid:

   mRNA-nivåene av VDR og CaSR vil bli estimert ved hjelp av Real-PCR (Stratagene Robocycler Gradient 40 system) ved bruk av spesifikke primersekvenser og PCR-betingelser. PCR-produktene vil bli separert ved elektroforese på 6 % agarosegel; produktene blir deretter farget med etidiumbromid og lokalisert ved fluorescens ved bruk av UV-lys. Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) vil bli brukt til å evaluere båndintensitetene til PCR-båndene.

2. Ekspresjonsstudie av VDR, CaSR,PTH, Cyclin D1, Ki67 og PCNA protein-

   Immunhistokjemi: Monoklonale antistoffer vil bli brukt til immunfarging av VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 og PCNA proteiner på parafinsnitt (Source-Pharmingen, USA). Sekundært antistoff, geit-anti-mus pepperrotperoksidase konjugert (BD Biosciences, Pharmingen, USA), spesifikt for primære antistoffer vil bli brukt i hver test. Indirekte immunoperoksidasemetode vil bli brukt for farging av parafinsnitt. I denne analysen binder det ukonjugerte primære antistoffet seg til antigenet i prøven. For å lokalisere denne tilknytningen brukes et peroksidasekonjugert spesifikt sekundært antistoff som binder seg til det primære antistoffet. Et substrat tilsettes deretter for å lokalisere reaksjonen.

   Objektglassene vil deretter bli undersøkt under lysmikroskopet. Farging vil bli gradert som negativ (0), mild (+), moderat (++) og markert (+++) avhengig av intensiteten av immunreaktivitet.

3. Sammenligning av proteinekspresjonsprofil-

   1. Ekstraksjon av proteiner 100 mg vev blir homogenisert med 0,5 ml kald (4°C) lyseringsbuffer. Protein vil bli estimert ved hjelp av Bicin Chronic Acid (BCA)-metoden og lagre det gjenværende ved -80°C.

   2. Separasjon fra første dimensjon (IEF) og andre dimensjon (SDS-PAGE) Den konsentrerte prøven vil bli solubilisert i rehydreringsbuffer. Totalt 125 - 200 µl vil bli lastet på 7 cm IPG-strimmel (Amersham). IEF-kjøring vil være i henhold til produsentens protokoll.

      For andre dimensjon vil IPG-strimlene bli ekvilibrert i 15 minutter med 6 ml ekvilibreringsbuffer. Hver IPG-strimmel vil bli lastet på 12 % polyakrylamidgel og elektroforert (100 eller 200 V i ~6 timer). Etter elektroforese vil proteiner fikseres og visualiseres ved hjelp av Coomassie- og Silver-farger.

   3. Bildeanalyse, in-gel trypsin fordøyelse og MALDI massespektrometri analyse Fargede geler vil bli skannet med GS-800 densitometer (Bio-Rad) ved bruk av PDQuest programvare (Bio-Rad) og proteinene av interesse vil bli analysert av MALDI-TOFMS ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) ved Institutt for mikrobiell teknologi (IMTech).

Proteiner vil bli identifisert ved peptidmasse-fingeravtrykk ved bruk av Mascot nettbaserte søkemotor ved hjelp av peptidmassespektra.