Regulación del Receptor de Vitamina D (VDR), Receptor Sensor de Calcio (CaSR), Ciclina D1, Ki67 y Antígeno Nuclear de Células Proliferantes (PCNA) en Hiperparatiroidismo Primario

Introducción:

El hiperparatiroidismo primario (HPTP) es el tercer trastorno endocrino más frecuente, después de la diabetes mellitus y los trastornos tiroideos, que afecta predominantemente a mujeres posmenopáusicas, con una incidencia de 1-5 por 1000 personas. Puede ocurrir a cualquier edad, aunque los jóvenes rara vez se ven afectados. El PHPT se caracteriza por la hipersecreción de hormona paratiroidea (PTH) y la hipercalcemia resultante. La mayoría de los casos de PHPT (>85%) se deben a un adenoma solitario en una de las glándulas paratiroides. La hiperplasia multiglándula se encuentra en alrededor del 10 al 15% de los pacientes, mientras que el carcinoma ocurre raramente (1 al 2%).

Las glándulas paratiroides regulan la homeostasis del calcio. Los principales órganos diana de la hormona paratiroidea (PTH) son los huesos y los riñones. La PTH aumenta la resorción ósea para movilizar el calcio hacia la circulación. En el riñón, la PTH aumenta la reabsorción de calcio y aumenta la excreción de fosfato. La PTH también estimula la producción renal de 1α,25-dihidroxivitamina D [1,25(OH)2D], que a su vez aumenta la absorción intestinal de calcio. Así, los efectos fisiológicos de la PTH son aumentar la concentración de calcio en la circulación. La retroalimentación negativa del calcio y la 1,25(OH)2D modulan la función paratiroidea. Estos efectos están mediados por el receptor sensible al calcio (CaSR) expresado en la superficie de las células paratiroideas. De manera similar, la 1,25(OH)2D actúa a través del receptor de vitamina D (VDR) y suprime la síntesis y secreción de PTH. Por lo tanto, la secreción de PTH está estrechamente relacionada con el nivel de calcio ambiental de las células paratiroideas.

El aumento de la proliferación de células paratiroideas y la disminución del control de la secreción de PTH mediada por calcio son hallazgos característicos en todos los tipos de hiperparatiroidismo (1-4). El calcio a través de su receptor, el CaSR y el complejo 1,25(OH)2D-VDR son los reguladores más importantes a este respecto. La disminución de las acciones de estos reguladores estimularía la proliferación de las células paratiroideas. Los análisis moleculares han revelado la presencia de reordenamientos de ADN específicos de tumores en un subconjunto de adenomas. En dichos reordenamientos, la región reguladora del gen 5' PTH se combina aguas arriba del gen Cyclin D1, lo que da como resultado una sobreexpresión de ciclinas que podrían inducir la proliferación al aumentar la tasa mitótica. De hecho, la sobreexpresión de ciclina D1 se demostró por primera vez en un paciente con adenoma paratiroideo (5).

La expresión alterada del gen CaSR se encuentra en lesiones paratiroideas de hiperparatiroidismo primario y secundario (6-11). No se encontraron mutaciones en el gen CaSR en las neoplasias paratiroideas (11,12). Hallazgos actuales similares muestran una expresión reducida del gen VDR (8,13-15) y coinciden con los estudios sobre la aparente falta de mutaciones del gen VDR en el hiperparatiroidismo (16-18). Se ha informado la expresión diferencial de los genes VDR y CaSR en algunos adenomas paratiroideos, pero se desconoce el mecanismo exacto. Estas observaciones plantean la posibilidad de que la expresión alterada de estos genes pueda estar relacionada con la patogenia de los adenomas paratiroideos.

OBJETIVOS: Para lograr el objetivo anterior, se llevarían a cabo los siguientes objetivos.

1. Comparación de la expresión de los genes VDR y CaSR en adenomas paratiroideos con tejido paratiroideo normal obtenido durante cirugía de pacientes no hiperparatiroideos por Real Time-PCR.
2. Para confirmar la expresión de VDR, CaSR, PTH ciclina D1, Ki67 y PCNA en células paratiroideas por inmunohistoquímica.
3. Comparación del perfil de expresión de proteínas de adenomas paratiroideos con tejido paratiroideo normal mediante análisis proteómico.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Asignaturas:

Todos los pacientes con PHPT que asisten a la clínica de pacientes al aire libre del departamento de Endocrinología y Cirugía General del Hospital Nehru, PGIMER, Chandigarh se incluirán en este estudio con los siguientes criterios de inclusión y exclusión.

Criterios de inclusión: Los pacientes con HPTP esporádico verificado quirúrgicamente y los controles se incluirán de la siguiente manera; Grupo A: ~ 20 pacientes con HPTP esporádico Grupo B: ~ 10 pacientes eutiroideos normocalcémicos operados por trastornos de la tiroides proporcionarán tejido paratiroideo normal para servir como tejido de control.

Criterios de exclusión: Se excluirán pacientes con hiperplasia, insuficiencia renal y neoplasia endocrina múltiple.

Recolección de muestras: las muestras de tejido paratiroideo se recolectarán inmediatamente después de la cirugía, se congelarán rápidamente y se almacenarán a -80oC hasta su uso.

Métodos de ensayo: Niveles preoperatorios de calcio sérico total (rango de referencia, 8.6-10.2 mg/dL) se determinará mediante un autoanalizador (Modular P: Roche Diagnostics, Alemania). El nivel de calcio sérico se corregirá con el nivel de albúmina sérica. La PTH sérica intacta (rango de referencia, 12-55 ng/L) y la 25-hidroxivitamina D (11,1-42,9 ng/ml) se medirá mediante inmunoquimioluminiscencia (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Alemania).

1. Estudio de expresión génica para VDR y CaSR-

   1. Extracción de ARN:

      El ARN total se extraerá de las muestras de tejido paratiroideo normal y adenomatoso crioconservadas mediante el uso del reactivo TRIZOL (Life Technologies, Inc.), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las muestras serán pretratadas con DNase y almacenadas a -80oC hasta su uso. El ADNc se generará a partir de 3-4 mg de ARN mediante transcriptasa inversa con hexámeros aleatorios como cebadores.

   2. Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real:

   Los niveles de ARNm de VDR y CaSR se estimarán mediante Real-PCR (sistema Stratagene Robocycler Gradient 40) utilizando secuencias de cebadores específicas y condiciones de PCR. Los productos de la PCR se separarán por electroforesis en gel de agarosa al 6 %; los productos se teñirán luego con bromuro de etidio y se localizarán mediante fluorescencia utilizando luz ultravioleta. Se utilizaría Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) para evaluar las intensidades de banda de las bandas de PCR.

2. Estudio de expresión de proteínas VDR, CaSR,PTH, Ciclina D1, Ki67 y PCNA-

   Inmunohistoquímica: se utilizarán anticuerpos monoclonales para la inmunotinción de proteínas VDR, CaSR, PTH, ciclina D1, Ki67 y PCNA en secciones de parafina (Source-Pharmingen, EE. UU.). En cada prueba se utilizará un anticuerpo secundario, conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-ratón de cabra (BD Biosciences, Pharmingen, EE. UU.), específico para anticuerpos primarios. Se utilizará el método de inmunoperoxidasa indirecta para la tinción de secciones de parafina. En este ensayo, el anticuerpo primario no conjugado se une al antígeno en la muestra. Para localizar esta unión, se usa un anticuerpo secundario específico conjugado con peroxidasa que se une al anticuerpo primario. A continuación, se añade un sustrato para localizar la reacción.

   Los portaobjetos se examinarán luego bajo el microscopio óptico. La tinción se calificará como negativa (0), leve (+), moderada (++) y marcada (+++) según la intensidad de la inmunorreactividad.

3. Comparación del perfil de expresión de proteínas-

   1. Extracción de Proteínas Se homogeneizarán 100 mg de tejido con 0,5 ml de tampón de lisis frío (4°C). La proteína se estimará mediante el método del ácido crónico de bicina (BCA) y se almacenará el resto a -80 °C.

   2. Separación de primera dimensión (IEF) y segunda dimensión (SDS-PAGE) La muestra concentrada se solubilizará en tampón de rehidratación. Se cargará un total de 125 - 200 µl en una tira de IPG de 7 cm (Amersham). La ejecución de IEF se realizará de acuerdo con el protocolo del fabricante.

      Para la segunda dimensión, las tiras de IPG se equilibrarán durante 15 min con 6 ml de tampón de equilibrio. Cada tira de IPG se cargará en gel de poliacrilamida al 12 % y se someterá a electroforesis (100 o 200 V durante ~6 h). Después de la electroforesis, las proteínas se fijarán y se visualizarán mediante las tinciones de Coomassie y Silver.

   3. Análisis de imágenes, digestión con tripsina en gel y análisis de espectrometría de masas MALDI Los geles teñidos se escanearán con un densitómetro GS-800 (Bio-Rad) usando el software PDQuest (Bio-Rad) y las proteínas de interés se analizarán con MALDI-TOFMS ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) en el Instituto de tecnología microbiana (IMTech).

Las proteínas se identificarán mediante huellas dactilares de masas de péptidos utilizando el motor de búsqueda basado en la web Mascot con la ayuda de espectros de masas de péptidos.