Regulação do Receptor de Vitamina D (VDR), Receptor Sensor de Cálcio (CaSR), Ciclina D1, Ki67 e Antígeno Nuclear de Proliferação Celular (PCNA) no Hiperparatireoidismo Primário

Introdução:

O hiperparatireoidismo primário (HPTP) é o terceiro distúrbio endócrino mais frequente, depois do diabetes mellitus e dos distúrbios da tireoide, que afeta predominantemente mulheres na pós-menopausa, com incidência de 1 -5 em 1.000 pessoas. Pode ocorrer em qualquer idade, embora os jovens raramente sejam afetados. O HPTP é caracterizado pela hipersecreção do hormônio da paratireoide (PTH) e hipercalcemia resultante. A maioria dos casos de HPTP (>85%) resulta de um adenoma solitário em uma das glândulas paratireoides. A hiperplasia multiglandular é encontrada em cerca de 10-15% dos pacientes, enquanto o carcinoma ocorre raramente (1-2%).

As glândulas paratireoides regulam a homeostase do cálcio. Os principais órgãos-alvo do hormônio da paratireoide (PTH) são os ossos e os rins. O PTH aumenta a reabsorção óssea para mobilizar o cálcio para a circulação. No rim, o PTH aumenta a reabsorção de cálcio e aumenta a excreção de fosfato. O PTH também estimula a produção renal de 1α,25-diidroxivitamina D [1,25(OH)2D], que por sua vez aumenta a absorção intestinal de cálcio. Assim, os efeitos fisiológicos do PTH são aumentar a concentração de cálcio na circulação. O feedback negativo do cálcio e 1,25(OH)2D modulam a função da paratireoide. Esses efeitos são mediados pelo receptor de detecção de cálcio (CaSR) expresso na superfície das células da paratireoide. Da mesma forma, 1,25(OH)2D, atua através do receptor de vitamina D (VDR) e suprime a síntese e secreção de PTH . Assim, a secreção de PTH está fortemente acoplada ao nível de cálcio ambiente das células paratireoidianas.

O aumento da proliferação das células da paratireoide e a diminuição do controle mediado pelo cálcio da secreção de PTH são achados característicos em todos os tipos de hiperparatireoidismo (1-4). O cálcio via seu receptor, o CaSR e o complexo 1,25(OH)2D-VDR são os reguladores mais importantes a esse respeito. Ações diminuídas desses reguladores estimulariam a proliferação das células da paratireoide. As análises moleculares revelaram a presença de rearranjos de DNA específicos do tumor em um subconjunto de adenomas. Em tais rearranjos, a região reguladora do gene PTH 5' se combina a montante do gene Cyclin D1, o que resulta em superexpressão de ciclinas que podem induzir a proliferação pelo aumento da taxa mitótica. De fato, a superexpressão da ciclina D1 foi demonstrada pela primeira vez em um paciente com adenoma da paratireoide (5).

A expressão prejudicada do gene CaSR é encontrada em lesões paratireoidianas de hiperparatireoidismo primário e secundário (6-11). Nenhuma mutação foi encontrada no gene CaSR em neoplasias da paratireoide (11,12). Achados semelhantes mostram expressão reduzida do gene VDR (8,13-15) e concordam com estudos sobre a aparente falta de mutações no gene VDR no hiperparatireoidismo (16-18). A expressão diferencial do gene VDR e CaSR foi relatada em alguns adenomas de paratireoide, mas o mecanismo exato não é conhecido. Essas observações levantam a possibilidade de que a expressão alterada desses genes possa estar relacionada à patogênese dos adenomas da paratireoide.

OBJETIVOS: Para alcançar o objetivo acima, os seguintes objetivos seriam empreendidos.

1. Comparação da expressão dos genes VDR e CaSR em adenomas de paratireoide com tecido paratireoidiano normal obtido durante cirurgia de pacientes não hiperparatireoidianos por Real Time-PCR.
2. Confirmar a expressão de VDR, CaSR, PTH ciclina D1, Ki67 e PCNA em células da paratireoide por imuno-histoquímica.
3. Comparação do perfil de expressão proteica de adenomas de paratireoide com tecido paratireoidiano normal por análise proteômica.

MATERIAIS E MÉTODOS:

Assuntos:

Todos os pacientes com HPPT atendidos na clínica externa do departamento de Endocrinologia e Cirurgia Geral do Hospital Nehru, PGIMER, Chandigarh serão incluídos neste estudo com os seguintes critérios de inclusão e exclusão.

Critérios de inclusão: Pacientes com HPTP esporádico verificado cirurgicamente e controles serão incluídos como segue; Grupo A: ~ 20 pacientes HPPT esporádicos Grupo B: ~ 10 pacientes eutireoideos normocalcêmicos operados por distúrbios da tireoide fornecerão tecido paratireoidiano normal para servir como tecido de controle.

Critérios de Exclusão: Serão excluídos pacientes com hiperplasia, insuficiência renal e neoplasia endócrina múltipla.

Coleta de amostras: As amostras de tecido da paratireoide serão coletadas imediatamente após a cirurgia, congeladas e armazenadas a -80oC até o uso.

Métodos de ensaio: níveis pré-operatórios de cálcio sérico total (intervalo de referência, 8,6-10,2 mg/dL) será determinado por autoanalisador (Modular P: Roche Diagnostics, Alemanha). O nível sérico de cálcio será corrigido com o nível sérico de albumina. O PTH sérico intacto (intervalo de referência, 12-55 ng/L) e 25-hidroxivitamina D (11,1-42,9 ng/ml) serão medidos por imunoquimiluminiscência (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Alemanha).

1. Estudo da expressão gênica para VDR e CaSR-

   1. extração de RNA:

      O RNA total será extraído das amostras criopreservadas de tecido paratireóide normal e adenomatoso usando o reagente TRIZOL (Life Technologies, Inc.), de acordo com as instruções do fornecedor. As amostras serão pré-tratadas com DNase e armazenadas a -80oC até o uso. O cDNA será gerado a partir de 3-4 mg de RNA por transcriptase reversa com hexâmeros aleatórios como primers.

   2. Reação em cadeia da polimerase em tempo real:

   Os níveis de mRNA de VDR e CaSR serão estimados por Real-PCR (sistema Stratagene Robocycler Gradient 40) usando sequências específicas de primers e condições de PCR. Os produtos de PCR serão separados por eletroforese em gel de agarose 6%; os produtos serão então corados com brometo de etídio e localizados por fluorescência usando luz ultravioleta. Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) seria usado para avaliar as intensidades das bandas de PCR.

2. Estudo da expressão das proteínas VDR, CaSR, PTH, Ciclina D1, Ki67 e PCNA

   Imuno-histoquímica: Anticorpos monoclonais serão utilizados para imunomarcação das proteínas VDR, CaSR, PTH, Ciclina D1, Ki67 e PCNA em cortes de parafina (Source-Pharmingen, EUA). Em cada teste será utilizado anticorpo secundário, conjugado com peroxidase de rábano anti-camundongo de cabra (BD Biosciences, Pharmingen, EUA), específico para anticorpos primários. O método de imunoperoxidase indireta será utilizado para a coloração dos cortes de parafina. Neste ensaio, o anticorpo primário não conjugado se liga ao antígeno na amostra. Para localizar esta ligação, é utilizado um anticorpo secundário específico conjugado com peroxidase que se liga ao anticorpo primário. Um substrato é então adicionado para localizar a reação.

   As lâminas serão então examinadas ao microscópio de luz. A coloração será classificada como negativa (0), leve (+), moderada (++) e acentuada (+++), dependendo da intensidade da imunorreatividade.

3. Comparação do perfil de expressão de proteínas

   1. Extração de Proteínas 100mg de tecido serão homogeneizados com 0,5 ml de tampão de lise frio (4°C). A proteína será estimada pelo método do ácido crônico de Bicina (BCA) e armazenará o restante a -80°C.

   2. Separação de Primeira Dimensão (IEF) e Segunda Dimensão (SDS-PAGE) A amostra concentrada será solubilizada em tampão de reidratação. Um total de 125 - 200 µl será carregado em uma tira IPG de 7 cm (Amersham). A execução do IEF será de acordo com o protocolo do fabricante.

      Para a segunda dimensão, as tiras IPG serão equilibradas por 15 min com 6 ml de tampão de equilíbrio. Cada tira de IPG será carregada em gel de poliacrilamida a 12% e submetida a eletroforese (100 ou 200 V por ~ 6 h). Após a eletroforese, as proteínas serão fixadas e visualizadas através das colorações de Coomassie e Silver.

   3. Análise de imagem, digestão com tripsina em gel e análise por espectrometria de massa MALDI Os géis corados serão escaneados com densitômetro GS-800 (Bio-Rad) usando o software PDQuest (Bio-Rad) e as proteínas de interesse serão analisadas pelo MALDI-TOFMS ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) no Instituto de tecnologia microbiana (IMTech).

As proteínas serão identificadas por impressão digital de massa de peptídeos usando o mecanismo de pesquisa baseado na Web da Mascot com a ajuda de espectros de massa de peptídeos.