Reglering av vitamin D-receptor (VDR), Kalcium Sensing Receptor (CaSR), Cyclin D1, Ki67 och Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) vid primär hyperparatyreoidism

Introduktion:

Primär hyperparatyreos (PHPT) är den tredje vanligaste endokrina störningen, efter diabetes mellitus och sköldkörtelsjukdomar, som främst drabbar postmenopausala kvinnor, med en incidens på 1-5 av 1000 personer. Det kan uppstå i alla åldrar även om unga människor sällan drabbas. PHPT kännetecknas av hypersekretion av bisköldkörtelhormon (PTH) och resulterande hyperkalcemi. De flesta fall av PHPT (>85%) beror på ett solitärt adenom i en av bisköldkörtlarna. Multikörtelhyperplasi finns hos cirka 10-15% av patienterna medan karcinom förekommer sällan (1-2%).

Biskjoldkörtlarna reglerar kalciumhomeostas. De viktigaste målorganen för bisköldkörtelhormon (PTH) är ben och njurar. PTH ökar benresorptionen för att mobilisera kalcium i cirkulationen. I njurarna ökar PTH kalciumåterabsorptionen och ökar fosfatutsöndringen. PTH stimulerar också njurproduktionen av 1α,25-dihydroxivitamin D [1,25(OH)2D], vilket i sin tur förbättrar intestinal absorption av kalcium. De fysiologiska effekterna av PTH är alltså att öka koncentrationen av kalcium i cirkulationen. Negativ återkoppling från kalcium och 1,25(OH)2D modulerar bisköldkörtelfunktionen. Dessa effekter medieras via den kalciumavkännande receptorn (CaSR) som uttrycks på bisköldkörtelcellytan. På liknande sätt verkar 1,25(OH)2D genom vitamin D-receptor (VDR) och undertrycker PTH-syntes och -sekretion. Således är PTH-sekretionen tätt kopplad till bisköldkörtelcellens omgivande kalciumnivå.

Ökad paratyreoideacellsproliferation och minskad kalciummedierad kontroll av PTH-utsöndringen är karakteristiska fynd vid alla typer av hyperparatyreoidism (1-4). Kalcium via sin receptor, CaSR och 1,25(OH)2D-VDR-komplexet är de viktigaste regulatorerna i detta avseende. Minskad verkan av dessa regulatorer skulle stimulera bisköldkörtelcellerna att föröka sig. Molekylära analyser har avslöjat närvaron av tumörspecifika DNA-omarrangemang i en undergrupp av adenom. I sådana omarrangemang kombineras 5'-PTH-genens reglerande region uppströms om Cyclin D1-genen, vilket resulterar i överuttryck av cykliner som kan inducera proliferation genom att öka mitotisk hastighet. Faktum är att Cyclin D1-överuttryck först påvisades hos en patient med bisköldkörteladenom (5).

Nedsatt CaSR-genuttryck finns i bisköldkörtelskador av både primär och sekundär hyperparatyreoidism (6-11). Inga mutationer kunde hittas i CaSR-genen vid bisköldkörtelneoplasier (11,12). Liknande nuvarande fynd visar minskat VDR-genuttryck (8,13-15) och överensstämmer med studier om den uppenbara avsaknaden av VDR-genmutationer vid hyperparatyreos (16-18). Differentiellt uttryck av VDR- och CaSR-genen har rapporterats i ett fåtal bisköldkörteladenom, men den exakta mekanismen är inte känd. Dessa observationer ger upphov till möjligheten att förändrat uttryck av dessa gener kan relateras till patogenesen av bisköldkörteladenom.

MÅL: För att uppnå ovanstående mål skulle följande mål uppnås.

1. Jämförelse av uttryck av VDR- och CaSR-gener i bisköldkörteladenom med normal bisköldkörtelvävnad erhållen under operation från icke-hyperparatyreoideapatienter med Real Time-PCR.
2. För att bekräfta uttryck av VDR, CaSR, PTH cyklin D1, Ki67 och PCNA i bisköldkörtelceller genom immunhistokemi.
3. Jämförelse av proteinuttrycksprofil för bisköldkörteladenom med normal bisköldkörtelvävnad genom proteomisk analys.

MATERIAL OCH METODER:

Ämnen:

Alla PHPT-patienter som besöker utomhuspatientkliniken på endokrinologi- och kirurgiavdelningen på Nehru Hospital, PGIMER, Chandigarh kommer att inkluderas i denna studie med följande inklusions- och uteslutningskriterier.

Inklusionskriterier: Patienter med kirurgiskt verifierad sporadisk PHPT och kontroller kommer att inkluderas enligt följande; Grupp A: ~ 20 sporadiska PHPT-patienter Grupp B: ~10 normokalcemiska euthyroidpatienter som opereras för sköldkörtelsjukdomar kommer att tillhandahålla normal bisköldkörtelvävnad för att fungera som kontrollvävnad.

Uteslutningskriterier: Patienter med hyperplasi, njursvikt och multipel endokrin neoplasi kommer att exkluderas.

Provtagning: Prover av bisköldkörtelvävnad kommer att tas omedelbart efter operationen, snabbfrysta och förvaras vid -80oC fram till användning.

Analysmetoder: Preoperativa nivåer av totalt serumkalcium (referensintervall, 8,6-10,2 mg/dL) kommer att bestämmas med autoanalysator (Modular P: Roche Diagnostics, Tyskland). Serumkalciumnivån kommer att korrigeras med serumalbuminnivån. Serumet intakt PTH (referensintervall, 12-55 ng/L) och 25-hydroxivitamin D (11,1-42,9 ng/ml) kommer att mätas med immunokemiluminiscens (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Tyskland).

1. Genuttrycksstudie för VDR och CaSR-

   1. RNA-extraktion:

      Totalt RNA kommer att extraheras från de kryokonserverade normala och adenomatösa bisköldkörtelvävnadsproverna med hjälp av TRIZOL-reagenset (Life Technologies, Inc.), enligt säljarens instruktioner. Proverna kommer att förbehandlas med DNase och förvaras vid -80oC fram till användning. cDNA:t kommer att genereras från 3-4 mg RNA genom omvänt transkriptas med slumpmässiga hexamerer som primrar.

   2. Polymeraskedjereaktion i realtid:

   mRNA-nivåerna av VDR och CaSR kommer att uppskattas med Real-PCR (Stratagene Robocycler Gradient 40-system) med användning av specifika primersekvenser och PCR-förhållanden. PCR-produkterna kommer att separeras genom elektrofores på 6% agarosgel; produkterna kommer sedan att färgas med etidiumbromid och lokaliseras genom fluorescens med UV-ljus. Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) skulle användas för att utvärdera bandintensiteterna för PCR-banden.

2. Expressionsstudie av VDR, CaSR,PTH, Cyclin D1, Ki67 och PCNA-protein-

   Immunhistokemi: Monoklonala antikroppar kommer att användas för immunfärgning av VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 och PCNA proteiner på paraffinsnitt (Source-Pharmingen, USA). Sekundär antikropp, get-anti-mus pepparrotsperoxidaskonjugerad (BD Biosciences, Pharmingen, USA), specifik för primära antikroppar kommer att användas i varje test. Indirekt immunoperoxidasmetod kommer att användas för färgning av paraffinsnitt. I denna analys binder den okonjugerade primära antikroppen till antigenet i provet. För att lokalisera denna bindning används en peroxidaskonjugerad specifik sekundär antikropp som binder till den primära antikroppen. Ett substrat tillsätts sedan för att lokalisera reaktionen.

   Objektglasen kommer sedan att undersökas under ljusmikroskopet. Färgning kommer att graderas som negativ (0), mild (+), måttlig (++) och markerad (+++) beroende på intensiteten av immunreaktivitet.

3. Jämförelse av proteinuttrycksprofil-

   1. Extraktion av proteiner 100 mg vävnad homogeniseras med 0,5 ml kall (4°C) lysbuffert. Protein kommer att uppskattas med Bicin Chronic Acid (BCA)-metoden och förvara återstående vid -80°C.

   2. Separation från första dimensionen (IEF) och andra dimensionen (SDS-PAGE) Det koncentrerade provet kommer att solubiliseras i rehydreringsbuffert. Totalt 125 - 200 µl kommer att laddas på 7 cm IPG-remsa (Amersham). IEF-körning kommer att ske enligt tillverkarens protokoll.

      För andra dimensionen kommer IPG-remsorna att ekvilibreras i 15 minuter med 6 ml ekvilibreringsbuffert. Varje IPG-remsa kommer att laddas på 12 % polyakrylamidgel och genomgå elektrofores (100 eller 200 V i ~6 timmar). Efter elektrofores fixeras proteiner och visualiseras med hjälp av Coomassie och Silver-färger.

   3. Bildanalys, in-gel trypsindigestion och MALDI-masspektrometrianalys Färgade geler kommer att skannas med GS-800 densitometer (Bio-Rad) med PDQuest-mjukvara (Bio-Rad) och proteinerna av intresse kommer att analyseras av MALDI-TOFMS ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) vid Institutet för mikrobiell teknologi (IMTech).

Proteiner kommer att identifieras genom peptidmass-fingeravtryck med Mascot webbbaserad sökmotor med hjälp av peptidmasspektra.