Regolazione del recettore della vitamina D (VDR), recettore sensibile al calcio (CaSR), ciclina D1, Ki67 e antigene nucleare cellulare proliferante (PCNA) nell'iperparatiroidismo primario

Introduzione:

L'iperparatiroidismo primario (PHPT) è il terzo disturbo endocrino più frequente, dopo il diabete mellito e i disturbi della tiroide, che colpisce prevalentemente le donne in postmenopausa, con un'incidenza di 1-5 persone su 1000. Può verificarsi a qualsiasi età anche se i giovani sono raramente colpiti. PHPT è caratterizzato da ipersecrezione di ormone paratiroideo (PTH) e conseguente ipercalcemia. La maggior parte dei casi di PHPT (>85%) deriva da un adenoma solitario in una delle ghiandole paratiroidi. L'iperplasia multighiandolare si riscontra in circa il 10-15% dei pazienti mentre il carcinoma si verifica raramente (1-2%).

Le ghiandole paratiroidi regolano l'omeostasi del calcio. I principali organi bersaglio dell'ormone paratiroideo (PTH) sono le ossa ei reni. Il PTH aumenta il riassorbimento osseo per mobilizzare il calcio nella circolazione. Nel rene, il PTH aumenta il riassorbimento del calcio e aumenta l'escrezione di fosfato. Il PTH stimola anche la produzione renale di 1α,25-diidrossivitamina D [1,25(OH)2D], che a sua volta migliora l'assorbimento intestinale del calcio. Pertanto, gli effetti fisiologici del PTH sono di aumentare la concentrazione di calcio nella circolazione. Feedback negativo da calcio e 1,25(OH)2D modulano la funzione paratiroidea. Questi effetti sono mediati dal recettore sensibile al calcio (CaSR) espresso sulla superficie delle cellule paratiroidee. Allo stesso modo, l'1,25(OH)2D agisce attraverso il recettore della vitamina D (VDR) e sopprime la sintesi e la secrezione di PTH. Pertanto, la secrezione di PTH è strettamente accoppiata al livello di calcio ambientale della cellula paratiroidea.

L'aumento della proliferazione delle cellule paratiroidee e la riduzione del controllo calcio-mediato della secrezione di PTH sono segni caratteristici di tutti i tipi di iperparatiroidismo (1-4). Il calcio tramite il suo recettore, il CaSR e il complesso 1,25(OH)2D-VDR sono i regolatori più importanti, a questo proposito. La diminuzione delle azioni di questi regolatori stimolerebbe la proliferazione delle cellule paratiroidee. Le analisi molecolari hanno rivelato la presenza di riarrangiamenti del DNA tumore-specifici in un sottogruppo di adenomi. In tali riarrangiamenti, la regione regolatrice del gene 5' PTH si combina a monte del gene Cyclin D1, il che si traduce in una sovraespressione di cicline che potrebbe indurre la proliferazione aumentando la velocità mitotica. Infatti la sovraespressione di ciclina D1 è stata dimostrata per la prima volta in un paziente con adenoma paratiroideo (5).

L'espressione alterata del gene CaSR si riscontra nelle lesioni paratiroidee dell'iperparatiroidismo primario e secondario (6-11). Non sono state riscontrate mutazioni nel gene CaSR nelle neoplasie paratiroidee (11,12). Simili risultati attuali mostrano una ridotta espressione del gene VDR (8,13-15) e concordano con gli studi sull'apparente mancanza di mutazioni del gene VDR nell'iperparatiroidismo (16-18). L'espressione differenziale del gene VDR e CaSR è stata riportata in alcuni adenomi paratiroidei, ma il meccanismo esatto non è noto. Queste osservazioni sollevano la possibilità che l'espressione alterata di questi geni possa essere correlata alla patogenesi degli adenomi paratiroidei.

OBIETTIVI: Per raggiungere l'obiettivo di cui sopra, sarebbero intrapresi i seguenti obiettivi.

1. Confronto dell'espressione dei geni VDR e CaSR negli adenomi paratiroidei con tessuto paratiroideo normale ottenuto durante l'intervento chirurgico da pazienti non iperparatiroidei mediante Real Time-PCR.
2. Per confermare l'espressione di VDR, CaSR, PTH ciclina D1, Ki67 e PCNA nelle cellule paratiroidee mediante immunoistochimica.
3. Confronto del profilo di espressione proteica degli adenomi paratiroidei con il normale tessuto paratiroideo mediante analisi proteomica.

MATERIALI E METODI:

Soggetti:

Tutti i pazienti PHPT che frequentano la clinica per pazienti all'aperto del dipartimento di endocrinologia e chirurgia generale dell'ospedale Nehru, PGIMER, Chandigarh saranno inclusi per questo studio con i seguenti criteri di inclusione ed esclusione.

Criteri di inclusione: i pazienti con PHPT sporadico verificato chirurgicamente e i controlli saranno inclusi come segue; Gruppo A: ~ 20 pazienti con PHPT sporadici Gruppo B: ~ 10 pazienti eutiroidei normocalcemici operati per disturbi della tiroide forniranno tessuto paratiroideo normale come tessuto di controllo.

Criteri di esclusione: Saranno esclusi i pazienti con iperplasia, insufficienza renale e neoplasia endocrina multipla.

Raccolta dei campioni: i campioni di tessuto paratiroideo verranno raccolti immediatamente dopo l'intervento chirurgico, congelati a scatto e conservati a -80oC fino al momento dell'uso.

Metodi di analisi: livelli preoperatori di calcio sierico totale (intervallo di riferimento, 8,6-10,2 mg/dL) sarà determinato mediante auto-analizzatore (Modular P: Roche Diagnostics, Germania). Il livello sierico di calcio sarà corretto con il livello di albumina sierica. Il PTH sierico intatto (intervallo di riferimento, 12-55 ng/L) e la 25-idrossivitamina D (11,1-42,9 ng/ml) saranno misurati mediante immunochemiluminescenza (ELECSYS-2010: Roche Diagnostics, Germania).

1. Studio dell'espressione genica per VDR e CaSR-

   1. Estrazione dell'RNA:

      L'RNA totale sarà estratto dai campioni di tessuto paratiroideo normale e adenomatoso crioconservati utilizzando il reagente TRIZOL (Life Technologies, Inc.), secondo le istruzioni del fornitore. I campioni saranno pretrattati con DNasi e conservati a -80oC fino al momento dell'uso. Il cDNA sarà generato dai 3-4 mg di RNA mediante trascrittasi inversa con esameri casuali come primer.

   2. Reazione a catena della polimerasi in tempo reale:

   I livelli di mRNA di VDR e CaSR saranno stimati mediante Real-PCR (sistema Stratagene Robocycler Gradient 40) utilizzando specifiche sequenze di primer e condizioni di PCR. I prodotti di PCR saranno separati mediante elettroforesi su gel di agarosio al 6%; i prodotti saranno poi colorati con bromuro di etidio e localizzati mediante fluorescenza mediante luce UV. Bio Max 1D TM 1.5.1 (Kodak, Rochester, NY) verrebbe utilizzato per valutare le intensità di banda delle bande PCR.

2. Studio dell'espressione di proteine ​​VDR, CaSR, PTH, ciclina D1, Ki67 e PCNA-

   Immunoistochimica: Gli anticorpi monoclonali saranno utilizzati per l'immunocolorazione delle proteine ​​VDR, CaSR, PTH, Cyclin D1, Ki67 e PCNA su sezioni di paraffina (Fonte - Pharmingen, USA). In ogni test verrà utilizzato l'anticorpo secondario, coniugato con perossidasi di rafano di capra anti-topo (BD Biosciences, Pharmingen, USA), specifico per gli anticorpi primari. Per la colorazione delle sezioni in paraffina verrà utilizzato il metodo dell'immunoperossidasi indiretta. In questo test, l'anticorpo primario non coniugato si lega all'antigene nel campione. Per localizzare questo attacco, viene utilizzato un anticorpo secondario specifico coniugato con perossidasi che si lega all'anticorpo primario. Viene quindi aggiunto un substrato per localizzare la reazione.

   I vetrini saranno poi esaminati al microscopio ottico. La colorazione sarà classificata come negativa (0), lieve (+), moderata (++) e marcata (+++) a seconda dell'intensità dell'immunoreattività.

3. Confronto del profilo di espressione proteica-

   1. Estrazione delle proteine ​​100mg di tessuto saranno omogeneizzati con 0.5 ml di tampone di lisi freddo (4°C). Le proteine ​​saranno stimate con il metodo dell'acido cronico Bicin (BCA) e conservate le rimanenti a -80°C.

   2. Separazione di Prima Dimensione (IEF) e Seconda Dimensione (SDS-PAGE) Il campione concentrato sarà solubilizzato in tampone di reidratazione. Un totale di 125 - 200 µl verrà caricato su una striscia IPG da 7 cm (Amersham). La corsa IEF sarà conforme al protocollo del produttore.

      Per la seconda dimensione le strisce IPG saranno equilibrate per 15 min con 6 ml di tampone di equilibrazione. Ogni striscia IPG sarà caricata su gel di poliacrilammide al 12% ed elettroforetica (100 o 200 V per ~6 h). Dopo l'elettroforesi, le proteine ​​verranno fissate e visualizzate mediante colorazione Coomassie e Silver.

   3. Analisi delle immagini, digestione con tripsina in-gel e analisi della spettrometria di massa MALDI I gel colorati saranno scansionati con il densitometro GS-800 (Bio-Rad) utilizzando il software PDQuest (Bio-Rad) e le proteine ​​di interesse saranno analizzate dal MALDI-TOFMS ( Voyager DE-PRO, Applied Biosystems) presso l'Istituto di tecnologia microbica (IMTech).

Le proteine ​​saranno identificate mediante fingerprinting di massa dei peptidi utilizzando il motore di ricerca web basato su Mascot con l'aiuto degli spettri di massa dei peptidi.