慢性シャーガス病患者の寄生虫反応を評価するための PCR 技術の最適化 (PCR)

シャーガス病 (CD) は、世界で最も無視されている病気の 1 つです。 ラテンアメリカでは、21 か国で CD が流行しており、推定 1 億 800 万人がこの病気にかかるリスクにさらされています。 1980 年代の推定では、約 1,600 ～ 1,800 万人が感染していることが示されています。 1990年代に多国間で一連の抑制策が講じられた後、2001年には感染者数の推計が980万人に修正された。 障害調整生存年（DALY）に基づく推定疾病負担は、1990 年の 270 万人から 2001 年には 586,000 人に減少しました。 汎米保健機関 (PAHO) の 2006 年の最近の推計では、年間 754 万人の感染者と 55,185 人の新規感染者が示されています。 アメリカトリパノソーマ症としても知られる CD は、主にサシ科亜科の大型の吸血性赤虫によって伝染する原虫血鞭毛虫トリパノソーマ クルーズによって引き起こされる人獣共通感染症です。 臨床的に、ヒトの CD には急性と慢性の 2 つの段階があります。 数週間続く急性期は発熱性の有毒疾患であり、この期間中は新鮮な血液を直接検査することで寄生虫を検出できます。 慢性期の診断は、さまざまな程度の感受性の血液培養、異種診断、PCR、または IgG 抗体の検出に依存します。 治療しなければ、慢性期は生涯続きます。 この病気は、特定の症状や臨床症状を示さずに始まり、約 10 年から 15 年間続く「不定型」の病気です。 分析された流行地域に応じて、その後数年間で慢性シャーガス患者の約 20 ～ 50% が心臓または胃腸管の病変を発症します。 CD の現在の治療法は、ニフルティモックスとベンズニダゾールの 2 つのニトロ複素環系薬剤に限定されており、後者はシャーガス病の治療に最も広く使用されている薬剤です。 治療の適応症は、急性疾患（先天性感染症を含む）、初期の慢性疾患（つまり、15歳未満の小児および慢性感染症の初期段階にある患者）、さらに免疫抑制による感染の再活性化です。

後期慢性期は臨床医の裁量で治療されます。 必要性の階層では、病気の不確定段階にある患者が新しい治療法の評価の主な対象集団になると主張されています。 病気の発生率が減少するにつれて、新規感染者数が最も多い国でも、病気の負担が最も大きくなるのは無症候性の慢性期の患者です。 例えばボリビアでは、少なくとも20万人の15歳未満の子供と100万人の成人がT. cruziに感染しており、合計で推定合計70万人が不定型または無症候性の慢性期患者となっている。 進行中の感染症を患う何百万人もの人々に対する効果的で手頃な治療法の開発と慢性合併症の予防は、CD における疾病管理の重要な優先事項として認識されています。 治癒の評価は CD の治療で最も複雑な側面と考えられており、多くの場合、多様で物議を醸す結果につながります。 血液だけでなく組織からも寄生虫を完全に除去する必要があることを考えると、寄生虫学的治療という用語は解釈が難しく、評価も困難です。 臨床治療には長期的な評価が必要ですが、寄生虫の作用、宿主の反応、およびそれらの結果として生じる臨床症状が長期間にわたって変化するという病気の病因により、不確実な性質を持つことがよくあります。 近年、急性および不確定のシャーガス病の代替マーカーとして寄生虫学的結果を使用する強力な生物学的根拠が指摘されるデータが増えています。 免疫応答の永続と病気の進行における T. cruzi の持続性の役割を示す証拠が増えています。 また、長期追跡調査を行った最近の非ランダム化臨床試験では、慢性CD患者における抗寄生虫化学療法のプラスの効果と、これらの所見と血清学の結果との相関関係が実証されています。 したがって、臨床開発と概念実証の目的で、急性疾患と慢性疾患の両方における反応の評価に寄生虫学的検査と血清学的検査を使用することが提案されています。 治療終了時の直接塗抹標本が陰性であれば、急性患者の反応の証拠として一般に受け入れられています。 慢性疾患では、連続血液培養、異種診断、または PCR を使用して血清学的評価をサポートでき、寄生虫学的結果が陽性であれば治療の失敗を示します。 血液培養および異種診断は、慢性患者では感度が低い可能性がある技術であり、適切なリソース/インフラストラクチャと非常に熟練した人材が必要です。 従来の血清学に関しては、不特定の慢性患者の場合、抗体力価の低下には最長 5 年かかり、陰性への血清変換は 5 ～ 10 年後に起こります。 結果として、不特定の疾患における臨床研究の有効性評価を定性的および定量的 PCR を使用して行うことが提案されています。 しかし、公表された研究における PCR の臨床感度と特異度には大きなばらつきがあり、疾患の段階ごとに違いが見られ、使用されている多くの技術には標準化が必要です。 特に、循環寄生虫のレベルが低いことと寄生虫血症の自然な変動により、慢性シャーガス病における PCR の感度について懸念されています。 最新の研究では、免疫抑制シャーガス病患者や先天性感染新生児などの寄生虫負荷が高い症例や、未確定段階または病因が解明されていない患者など寄生虫血症が少ない症例でも直接測定できる PCR の使用のダイナミックレンジが広いことが示されています。処理。 PCR 検査は心臓移植後の T. cruzi 再活性化の早期検出にも使用されており、臨床的再活性化の診断の前に寄生虫負荷の増加が検出されることが文書化されています。 さらに、寄生虫血症と組織感染との間にある程度の相関関係があることを示唆する臨床データおよび実験データが蓄積されている。 近年のもう 1 つの重要な進歩は、T. cruzi の定性 PCR 検査の標準化と実験室での検証を目的とした TDR の後援による研究です。 PCR の定性的評価のための標準化された手順 (標準およびリアルタイム PCR) が選択されており、より高い分析感度と特異性、再現性が得られ、アッセイ内およびアッセイ間の変動と精度が低レベルです。 この演習の結果は、11 月 8 日にブエノスアイレスでの会議で発表され、近い将来発表される予定です。 しかし、慢性不確定性 CD 患者に対する治療の有効性に関する情報は限られており、寄生虫学的反応を評価するために PCR を使用した研究はわずか数例しかありません。 DNDi と CD プロトコル開発チームが主催した 3 回の会議における CD の専門家パネルは、不特定の慢性疾患における寄生虫反応のマーカーとしての PCR の評価を支持しました。 これらの議論の中で、PCR 検査の感度を高めるために、定性 PCR アッセイに連続採血を使用する価値について合意が得られました。

この情報を裏付けるデータは、毎月の採血による追跡調査を行っている 41 人の妊婦からなるアルゼンチン人コホートに限定されています。 この小グループでは、PCR 感度は 1 回の採血で 60.2%、2 回の採血で 74%、3 回の採血で 80.5% でした (A. シジマン、原稿準備中）。 さらに、2002 年に発表された Castro の研究では、2 番目のサンプルの追加により PCR の感度が 70.0% から 81.7% に大幅に増加することが示されました (P=0.03)。 3 番目のサンプルを追加すると、感度は 86.7% まで有意ではありませんでした。 残念ながら、サンプルサイズは小さく、サンプリング間隔の指示はなく、定性的 PCR 技術は標準化されていませんでした。 パネルディスカッションでは、感度を最大化するための血液サンプリングの明確な間隔を裏付ける情報が不足しているため、連続サンプリングの正確な間隔について合意はありませんでした。 異種診断で得られたデータは、慢性チャガス症患者には概日リズムとT. cruzi周期性の両方が存在しないことを示唆しています。 したがって、サンプリング手順を定義するときは、PCR 感度の向上と、現場で臨床試験を実施する際のロジスティックス/実現可能性のバランスを取る必要があります。 CDに関する将来の臨床試験に備えるために、DNDiは、慢性不定型CD患者における寄生虫学的評価のツールとしてPCR実施手順を評価し、最適化する必要があることを認識している。 研究の倫理的承認は国境なき医師団の倫理審査委員会と、ボリビアのコチャバンバにある医療機関の倫理審査委員会（CEADES）から求められます。 さらに、この研究は国家シャーガス管理プログラムおよびボリビアのサルード大臣「科学研究委員会」によって提出され、審査される予定です。 これは、ベースラインでの複数回の PCR 血液サンプリング手順が 1 回のサンプリングと比較して高い感度を提供できるかどうか、また現場での実現可能性を評価することを目的とした記述研究です。 ベースラインおよび EOT の血液サンプリングは次のとおりです。最初に 10 mL の血液サンプルを 1 つ (サンプル 1)、続いてその直後に 5 mL の血液サンプルを 1 つ採取します (サンプル 2)。加えて、1 週間後に採取した 10 mL の血液サンプル 1 つ (サンプル 3)。 合計3つの血液サンプル。 6 か月および 12 か月後のフォローアップ訪問では、EOT での最適なサンプリング戦略のみが使用されます。

サンプリング戦略:

血液サンプルの数に応じた PCR 感度を調査するために、PCR 結果は単一のアッセイとして分析されるだけでなく、データ分析段階で、特定の時点での患者の PCR 結果を組み合わせることによって分析されます。

• 使用する参照 現在の戦略 (CS): サンプル 1 : 10 ml の単一サンプル 2 つの主要なタイプの戦略が開発される可能性があり、評価が必要です。
• 強化戦略 (RS) は、現在の単一サンプルのアプローチ (容量 10 ml) に血液サンプリングを追加することから成ります。 追加のサンプリングによってさらなる PCR 陽性症例の検出ができない限り (その可能性は低いですが)、この戦略は必然的に現在の戦略よりも感度が高くなります。
• 代替戦略 (SS) は、現在のアプローチ (サンプル 1 = 10 ml) を 5 ml のサンプリング (サンプル 2) と、場合によっては追加のサンプリング (サンプル 3) に置き換えることから構成されます。 これらの戦略は必ずしも現在の戦略より優れているわけではありません。

研究サイト:

本研究は、ボリビアのナルシソ・カンペロ州のアイキーレ、オメラケ、パソラパの自治体の農村地域で実施される。そこでは国境なき医師団が地元住民と協力して「シャーガス病の予防、診断、治療」プログラムを確立している。保健当局。 地元の人口は約 40,000 人で、国内で CD の負担が最も高い地域の 1 つに住んでいます。 このプログラムでは、農村地域に住む人々がシャーガス病の検査を受け、資格を満たす人が研究に参加するよう招待されます。 MSFとそのパートナーは、研究への参加の有無にかかわらず、すべてのシャーガス陽性被験者に病気の治療と管理の平等な機会を提供する。

主なエントリー基準:

対象/除外 ベンズニダゾールによる治療の適応がある慢性 CD 患者。 患者は、研究に登録するには次の適格基準を満たす必要があります。

包含基準:

• 18～60歳以上の年齢
• シャーガス血清学による T. cruzi 感染の診断。 3 つの血清学的検査のうち 2 つが陽性でなければなりません (従来の ELISA、組換え ELISA、または HAI)
• 書面によるインフォームドコンセントフォーム

除外基準:

• スクリーニング時に妊娠検査で陽性反応が出た生殖年齢の女性、または授乳中の女性 注: 生殖年齢の女性は、治験の全治療段階で避妊方法の使用を受け入れる必要があります。
• 活動性肺結核および肝不全または腎不全の臨床徴候などの重篤な健康状態の現在の症状。
• シャーガス心筋症ステージ II、III、IV (NYHA 分類による)
• ペースメーカーの埋め込みまたはその他の重篤な心臓伝導欠陥を必要とする被験者
• 過去におけるベンズニダゾールまたはニフルチモックスによるCD治療歴
• フォローアップに応じられない、および/または定住住所を持たない
• アルコール乱用またはその他の薬物中毒の病歴 注：この研究に参加するすべての患者は、MSFがアイキーレの農村地域で提供する日常ケアに従って、ベンズニダゾール5mg/kg/日の経口投与で60日間治療される。 この治療は、ボリビアのサルード・デポルテス大臣からの現地の推奨事項に従っています。 この研究への患者の参加は任意であり、研究期間中いつでも患者が同意を拒否したり撤回したりしても、シャーガス病の治療を受ける権利には影響しません。