Optymalizacja techniki PCR do oceny odpowiedzi parazytologicznej u pacjentów z przewlekłą chorobą Chagasa (PCR)

Choroba Chagasa (CD) należy do najbardziej zaniedbywanych chorób na świecie. W Ameryce Łacińskiej 21 krajów jest endemicznych dla CD, a około 108 milionów ludzi jest zagrożonych tą chorobą. Szacunki z lat 80. wskazywały, że zakażonych było około 16-18 milionów osób. W latach 90., po serii międzynarodowych inicjatyw kontrolnych, szacunki liczby zarażonych osób zostały skorygowane do 9,8 miliona w 2001 r. Szacunkowe obciążenie chorobami wyrażone w latach życia skorygowanych niepełnosprawnością (DALY) spadło z 2,7 miliona w 1990 roku do 586 000 w 2001 roku. Ostatnie szacunki Panamerykańskiej Organizacji Zdrowia (PAHO) z 2006 r. wskazują na 7,54 miliona zarażonych osób i 55 185 nowych przypadków rocznie. CD, znana również jako trypanosomatoza amerykańska, jest chorobą odzwierzęcą wywoływaną przez pierwotniaka hemoflagellata Trypanosoma cruzi, przenoszoną głównie przez duże, krwiopijne pluskwiaki z podrodziny Triatominae. Klinicznie choroba CD u ludzi ma dwie fazy, ostrą i przewlekłą. Faza ostra, która trwa kilka tygodni, jest chorobą przebiegającą z gorączką i zatruciem, podczas której można wykryć pasożyta poprzez bezpośrednie badanie świeżej krwi. W fazie przewlekłej rozpoznanie zależy od posiewów krwi o różnym stopniu czułości, ksenodiagnostyki, PCR lub wykrycia przeciwciał IgG. Nieleczona faza przewlekła trwa do końca życia. Rozpoczyna się bez specyficznych objawów lub objawów klinicznych przez okres około 10 lub 15 lat, „nieokreślona postać” choroby. Około 20 do 50% pacjentów z przewlekłym Chagasem w następnych latach, w zależności od analizowanego obszaru endemicznego, rozwinie zajęcie serca lub przewodu pokarmowego. Obecna terapia CD jest ograniczona do dwóch leków nitroheterocyklicznych, Nifurtimoksu i Benznidazolu, który później jest najczęściej stosowanym lekiem w leczeniu choroby Chagasa. Wskazaniem do leczenia jest choroba ostra (w tym infekcja wrodzona) i wczesna choroba przewlekła (tj. u dzieci <15 r.ż. i u pacjentów we wczesnej fazie infekcji przewlekłej) oraz reaktywacja infekcji przez immunosupresję.

Późna faza przewlekła jest leczona według uznania lekarza. Argumentowano, że w hierarchii potrzeb pacjenci w nieokreślonej fazie choroby stanowiliby główną populację docelową do oceny nowych metod leczenia. Przy malejącej zachorowalności, nawet w krajach o największej liczbie nowych zachorowań, największe obciążenie chorobą występuje wśród pacjentów w bezobjawowej, przewlekłej fazie choroby. Na przykład Boliwia ma co najmniej 200 000 dzieci w wieku poniżej 15 lat i 1 milion dorosłych zakażonych T. cruzi, co daje szacunkową liczbę 700 000 osób z nieokreśloną postacią lub bezobjawową fazą przewlekłą. Opracowanie skutecznego i przystępnego cenowo leczenia dla milionów ludzi z trwającymi infekcjami oraz zapobieganie przewlekłym powikłaniom jest uznawane za kluczowy priorytet kontroli choroby w CD. Ocena wyleczenia jest uważana za najbardziej złożony aspekt leczenia CD, prowadząc często do zróżnicowanych i kontrowersyjnych wyników. Pojęcie wyleczenia parazytologicznego jest trudne w interpretacji i trudne do oceny ze względu na konieczność całkowitej eliminacji pasożytów nie tylko z krwi, ale także z tkanek. Kliniczne wyleczenie wymaga długoterminowej oceny i często ma niepewny charakter ze względu na patogenezę choroby, w której działanie pasożyta, odpowiedź żywiciela i wynikające z nich objawy kliniczne ewoluują przez długi czas. W ostatnich latach coraz więcej danych wskazuje na silne biologiczne uzasadnienie stosowania wyników parazytologicznych jako zastępczych markerów ostrej i nieokreślonej choroby Chagasa. Istnieje coraz więcej dowodów na rolę utrzymywania się T. cruzi w utrwalaniu odpowiedzi immunologicznej i ewolucji choroby. Również ostatnie nierandomizowane badania kliniczne z długoterminową obserwacją wykazały pozytywny wpływ chemioterapii przeciwpasożytniczej u pacjentów z przewlekłą celiakią i korelację tych wyników z wynikami badań serologicznych. Dlatego też, dla celów rozwoju klinicznego i weryfikacji słuszności koncepcji, zasugerowano stosowanie testów parazytologicznych i serologicznych do oceny odpowiedzi zarówno w ostrych, jak i przewlekłych chorobach. Ujemny wynik wymazu bezpośredniego na koniec leczenia jest ogólnie akceptowany jako dowód odpowiedzi u pacjentów w stanie ostrym. W chorobach przewlekłych do oceny serologicznej można wykorzystać seryjną hemokulturę, ksenodiagnostykę lub PCR, a pozytywny wynik parazytologiczny wskazuje na niepowodzenie leczenia. Hemokultura i ksenodiagnostyka to techniki, które mogą wykazywać niską czułość u pacjentów przewlekle, wymagają odpowiednich zasobów/infrastruktury i bardzo umiejętnego personelu. W odniesieniu do konwencjonalnej serologii, u pacjentów z nieokreśloną przewlekłą chorobą, spadek miana przeciwciał może trwać do 5 lat, a serokonwersja do ujemnej występuje po 5-10 latach. W związku z tym proponuje się, aby ocena skuteczności badań klinicznych w nieustalonej chorobie była dokonywana za pomocą jakościowego i ilościowego PCR. Jednak w opublikowanych badaniach zaobserwowano znaczną zmienność czułości klinicznej i swoistości PCR, przy czym różnice obserwowano w różnych fazach choroby i wielu stosowanych technikach wymagających standaryzacji. W szczególności pojawiły się obawy dotyczące czułości PCR w przewlekłej chorobie Chagasa ze względu na niski poziom krążących pasożytów i naturalne fluktuacje parazytemii. Ostatnie badania wykazały szeroki zakres dynamiki do zastosowania PCR, umożliwiając bezpośrednie pomiary w przypadkach z dużym obciążeniem pasożytami, takich jak pacjenci z chorobą Chagasa z obniżoną odpornością i wrodzonymi zakażeniami noworodków, jak również w przypadkach z niskimi parazytemiami, takimi jak pacjenci w fazie nieokreślonej lub w etiologii leczenie. Test PCR był również stosowany do wczesnego wykrywania reaktywacji T. cruzi po przeszczepie serca, z udokumentowanym wykryciem wzrostu obciążenia pasożytami, przed rozpoznaniem reaktywacji klinicznej. Ponadto istnieje coraz więcej danych klinicznych i eksperymentalnych sugerujących stopień korelacji między parazytemią a zakażeniem tkanek. Innym ważnym postępem w ostatnich latach było sponsorowane przez TDR badanie mające na celu standaryzację i walidację laboratoryjną jakościowych testów PCR na obecność T. cruzi. Wybrano znormalizowane procedury jakościowej oceny PCR (standardowy i PCR w czasie rzeczywistym), które zapewniają wyższą czułość i specyficzność analityczną, powtarzalność, przy niskim poziomie zmienności i dokładności wewnątrz- i między testami. Wyniki tego ćwiczenia zostały zaprezentowane na spotkaniu w Buenos Aires 8 listopada i oczekuje się, że zostaną opublikowane w najbliższej przyszłości. Istnieją jednak ograniczone informacje na temat skuteczności leczenia pacjentów z przewlekłą nieokreśloną postacią CD, a tylko kilka badań wykorzystywało PCR do oceny odpowiedzi parazytologicznej. Panel ekspertów ds. CD na trzech spotkaniach zorganizowanych przez DNDi i zespół opracowujący protokół CD poparł ocenę PCR jako markera odpowiedzi parazytologicznej w nieokreślonej chorobie przewlekłej. Podczas tych dyskusji osiągnięto konsensus co do wartości wykorzystania seryjnych pobrań krwi do jakościowych testów PCR w celu zwiększenia czułości testu PCR.

Dane potwierdzające te informacje są ograniczone do argentyńskiej kohorty 41 ciężarnych kobiet, u których co miesiąc pobierano krew. W tej małej grupie czułość PCR wynosiła 60,2% dla pojedynczego pobrania krwi, 74% dla 2 pobrań krwi i 80,5% dla 3 pobrań krwi (A. Schijman, rękopis w przygotowaniu). Ponadto badanie Castro opublikowane w 2002 roku wykazało znaczny wzrost czułości PCR z 70,0% do 81,7% po dodaniu drugiej próbki (P=0,03). Dodanie trzeciej próbki doprowadziło do nieistotnego wzrostu czułości do 86,7%. Niestety wielkość próby była niewielka, nie było wskazania odstępu czasu pobierania próbek, a technika jakościowego PCR była niestandaryzowana. Podczas dyskusji panelowych nie osiągnięto porozumienia co do dokładnego odstępu między kolejnymi próbkami, ze względu na brak informacji przemawiających za określeniem odstępu między próbkami krwi w celu maksymalizacji czułości. Dane uzyskane za pomocą ksenodiagnostyki sugerują brak zarówno rytmu okołodobowego, jak i okresowości T. cruzi u osób z przewlekłym chagazem. Dlatego przy definiowaniu procedur pobierania próbek należałoby zrównoważyć korzyści płynące z czułości PCR i logistyki/wykonalności przeprowadzania badań klinicznych w warunkach terenowych. Aby przygotować się do przyszłych badań klinicznych nad CD, DNDi uznaje potrzebę oceny i optymalizacji procedur wdrożenia PCR jako narzędzia oceny parazytologicznej u pacjentów z przewlekłą nieokreśloną postacią CD. O zgodę etyczną badania należy zwrócić się do Komisji Rewizyjnej Médecins Sans Frontières oraz Komisji Etycznej Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Cochabamba, Boliwia. Ponadto badanie zostanie przedłożone i ocenione przez Krajowy Program Kontroli Chagasa oraz „Comité de Ética e Investigación” del Ministerio de Salud w Boliwii. Jest to badanie opisowe, którego celem jest ocena, czy wielokrotne procedury pobierania krwi metodą PCR na początku badania mogą zapewnić wyższą czułość w porównaniu z pojedynczym pobieraniem próbek, a także ich wykonalność w warunkach terenowych. Pobieranie krwi dla linii podstawowej i EOT będzie następujące: jedna początkowa próbka krwi 10 ml (Próbka 1), a następnie 1 próbka krwi 5 ml pobrana bezpośrednio po niej (Próbka 2); plus jedna próbka krwi o objętości 10 ml pobrana 1 tydzień później (Próbka 3). W sumie 3 próbki krwi. Podczas wizyt kontrolnych po 6 i 12 miesiącach zostanie zastosowana tylko optymalna strategia pobierania próbek w EOT.

Strategie pobierania próbek:

W celu zbadania czułości PCR w zależności od liczby próbek krwi, wyniki PCR będą analizowane jako pojedyncze testy, jak również, na etapie analizy danych, poprzez połączenie wyników PCR dla pacjentów w danym punkcie czasowym.

• Odniesienie do zastosowania Obecna strategia (CS): Próbka 1: Pojedyncza próbka 10 ml Można opracować dwa główne rodzaje strategii, które wymagają oceny:
• Strategia wzmocnienia (RS), która polega na dodaniu pobierania krwi do obecnego podejścia z pojedynczą próbką (objętość 10 ml). O ile dodatkowe pobieranie próbek nie pozwoli na wykrycie dodatkowych przypadków PCR-dodatnich (co jest mało prawdopodobne), taka strategia będzie nieuchronnie bardziej czuła niż obecna.
• Strategia Substytucji (SS), która polega na zastąpieniu dotychczasowego podejścia (próbka 1 = 10 ml) przez pobranie 5 ml (próbka 2) i ewentualnie dalsze pobranie (próbki) (próbka 3). Strategie te niekoniecznie są lepsze niż obecna.

Miejsce badania:

Niniejsze badanie zostanie przeprowadzone w społecznościach wiejskich w gminach Aiquile, Omereque i Pasorapa w prowincji Narciso Campero w Boliwii, gdzie organizacja Médecins Sans Frontières ustanowiła program „Zapobiegania, diagnozowania i leczenia choroby Chagasa” we współpracy z lokalnymi władze sanitarne. Miejscowa populacja to ~40 000 osób, żyjących na jednym z obszarów o największym obciążeniu CD w kraju. W kontekście tego programu osoby mieszkające w społecznościach wiejskich zostaną przebadane pod kątem choroby Chagasa, a osoby spełniające kryteria zostaną zaproszone do udziału w badaniu. MSF i jego partnerzy zapewnią równe szanse leczenia i zarządzania chorobą wszystkim pacjentom z dodatnim wynikiem testu na Chagasa, niezależnie od udziału lub nie w badaniu.

Główne kryteria wejścia:

Włączenie / Wyłączenie Pacjenci z przewlekłą postacią CD ze wskazaniem do leczenia benznidazolem. Pacjenci muszą spełniać następujące kryteria kwalifikacji do udziału w badaniu:

Kryteria przyjęcia:

• Wiek od > 18 do 60 lat
• Diagnoza zakażenia T. cruzi za pomocą serologii Chagasa. Dwa z trzech testów serologicznych muszą być pozytywne (konwencjonalny ELISA, rekombinowany ELISA lub HAI)
• Pisemny formularz świadomej zgody

Kryteria wyłączenia:

• Kobiety w wieku rozrodczym, które podczas badania przesiewowego uzyskały pozytywny wynik testu ciążowego lub które karmią piersią Uwaga: Kobiety w wieku rozrodczym muszą wyrazić zgodę na stosowanie metody antykoncepcji podczas całej fazy leczenia w ramach badania
• Aktualne przedstawienie ciężkiego stanu zdrowia, takiego jak: czynna gruźlica płuc i objawy kliniczne niewydolności wątroby lub nerek.
• Kardiomiopatia Chagasa stopnia II, III i IV (wg klasyfikacji NYHA)
• Osoby wymagające wszczepienia rozrusznika serca lub innych poważnych wad przewodzenia w sercu
• Historia leczenia CD benznidazolem lub nifurtymoksem w dowolnym momencie w przeszłości
• Niemożność przestrzegania działań następczych i/lub brak stałego adresu
• Historia nadużywania alkoholu lub innych uzależnień od narkotyków Uwaga: wszyscy pacjenci biorący udział w tym badaniu będą leczeni benznidazolem w dawce 5 mg/kg dziennie PO BID przez 60 dni, zgodnie z rutynową opieką MSF w społecznościach wiejskich w Aiquile. Zabieg ten jest zgodny z lokalnymi zaleceniami Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia. Udział pacjenta w tym badaniu jest dobrowolny, a jego odmowa lub wycofanie zgody w dowolnym momencie w trakcie badania nie wpłynie na jego prawo do leczenia choroby Chagasa.