Optimalisering av PCR-teknikk for å vurdere parasitologisk respons for pasienter med kronisk Chagas-sykdom (PCR)

Chagas sykdom (CD) rangerer blant verdens mest forsømte sykdommer. I Latin-Amerika er 21 land endemiske for CD med anslagsvis 108 millioner mennesker i fare for å pådra seg sykdommen. Estimater fra 1980-tallet indikerte at rundt 16-18 millioner individer var smittet. På 1990-tallet, etter en rekke multinasjonale kontrollinitiativer, ble estimater av antall infiserte personer revidert til 9,8 millioner i 2001. Den estimerte sykdomsbyrden i form av funksjonshemmingsjusterte leveår (DALY) falt fra 2,7 millioner i 1990 til 586 000 i 2001. Nylige estimater fra Pan-American Health Organization (PAHO), 2006 indikerer 7,54 millioner infiserte mennesker og 55 185 nye tilfeller per år. CD, også kjent som amerikansk trypanosomiasis, er en zoonotisk sykdom forårsaket av den protozoiske hemoflagellaten Trypanosoma cruzi som hovedsakelig overføres av store, blodsugende, reduviide insekter fra underfamilien Triatominae. Klinisk har human CD to faser, akutt og kronisk. Den akutte fasen, som varer noen uker, er en febril og toksemisk sykdom, hvor parasitten kan oppdages ved direkte undersøkelse av friskt blod. I den kroniske fasen avhenger diagnosen av hemokulturer med ulik grad av sensitivitet, xenodiagnose, PCR eller påvisning av IgG-antistoffer. Ubehandlet fortsetter den kroniske fasen resten av en persons liv. Det begynner uten spesifikke symptomer eller kliniske manifestasjoner i en periode på omtrent 10 eller 15 år, den "ubestemte formen" av sykdommen. Omtrent 20 til 50 % av kroniske Chagas-pasienter i løpet av de påfølgende årene, avhengig av det endemiske området som er analysert, vil utvikle involvering av hjertet eller mage-tarmkanalen. Nåværende terapi for CD er begrenset til to nitroheterosykliske legemidler, Nifurtimox og Benznidazol, det senere er det mest brukte legemidlet for behandling av Chagas sykdom. Indikasjonene for behandling er akutt sykdom (inkludert medfødt infeksjon), og tidlig kronisk sykdom (det vil si hos barn < 15 år og pasienter i tidlig fase av kronisk infeksjon), pluss reaktivering av infeksjonen ved immunsuppresjon.

Sen kronisk fase behandles etter klinikerens skjønn. I et behovshierarki har det blitt hevdet at pasienter i den ubestemte fasen av sykdommen vil representere hovedmålpopulasjonen for evaluering av nye behandlinger. Med synkende forekomst av sykdommen, selv i land med det høyeste antallet nye tilfeller, er den høyeste sykdomsbyrden blant pasienter i den asymptomatiske, kroniske fasen av sykdommen. Bolivia, for eksempel, har minst 200 000 barn under 15 år og 1 million voksne infisert med T. cruzi, for anslagsvis totalt 700 000 personer med ubestemt form eller asymptomatisk, kronisk fase. Utvikling av effektiv og rimelig behandling for millioner av mennesker med pågående infeksjoner og forebygging av kroniske komplikasjoner er anerkjent som en nøkkelprioritet for sykdomskontroll i CD. Evalueringen av kur regnes som det mest komplekse aspektet ved behandling ved CD, noe som fører til ofte forskjellige og kontroversielle resultater. Begrepet parasittologisk kur er vanskelig å tolke og evalueringen utfordrende, i lys av behovet for total eliminering av parasitter ikke bare fra blod, men også fra vev. Klinisk kur krever langsiktig evaluering og er ofte av usikker natur på grunn av sykdommens patogenes, med virkningen av parasitten, vertsresponsen og deres påfølgende kliniske manifestasjoner som utvikler seg over lang tid. I løpet av de siste årene har en økende mengde data pekt på en sterk biologisk begrunnelse for bruk av parasittologiske utfall som surrogatmarkører for akutt og ubestemt Chagas sykdom. Det er økende bevis på rollen til T. cruzis utholdenhet i opprettholdelsen av immunresponsen og utviklingen av sykdommen. Nylige ikke-randomiserte kliniske studier med langtidsoppfølging har også vist en positiv effekt fra antiparasittisk kjemoterapi hos pasienter med kronisk CD og korrelasjonen av disse funnene med serologiske resultater. Derfor, for klinisk utvikling og proof-of-concept, har det blitt foreslått at parasitologiske og serologiske tester brukes for vurdering av respons ved både akutt og kronisk sykdom. Et negativt direkte utstryk ved slutten av behandlingen er generelt akseptert som bevis på respons hos akutte pasienter. Ved kronisk sykdom kan seriell hemokultur, xenodiagnose eller PCR brukes for å støtte serologisk vurdering og et positivt parasitologisk resultat indikerer behandlingssvikt. Hemokultur og xenodiagnose er teknikker som kan gi lav sensitivitet hos kroniske pasienter, de krever riktige ressurser/infrastruktur og svært dyktig personell. Når det gjelder konvensjonell serologi, med ubestemte kroniske pasienter, kan en reduksjon i antistofftitere ta opptil 5 år med serokonversjon til negativ etter 5-10 år. Som en konsekvens foreslås det at effektvurdering for kliniske studier ved ubestemmelig sykdom gjøres ved bruk av kvalitativ og kvantitativ PCR. Imidlertid har det vært betydelig variasjon i den kliniske sensitiviteten og spesifisiteten til PCR i publiserte studier, med forskjeller sett på tvers av faser av sykdommen og en rekke teknikker i bruk som krever standardisering. Spesielt har det vært bekymring angående følsomheten til PCR ved kronisk Chagas sykdom på grunn av de lave nivåene av sirkulerende parasitter og naturlige svingninger av parasitemia. Nyeste studier har vist et bredt dynamisk område for PCR-bruk som tillater direkte målinger i tilfeller med høy parasittisk belastning som pasienter med immunsupprimert Chagas sykdom og medfødt infiserte nyfødte, samt i tilfeller med lave parasitter, som pasienter i ubestemt fase eller under etiologisk behandling. PCR-testing har også blitt brukt for tidlig påvisning av T. cruzi-reaktivering etter hjertetransplantasjon, med dokumentert påvisning av parasittisk belastningsøkning, før diagnostisering av klinisk reaktivering. I tillegg er det påløpende kliniske og eksperimentelle data som tyder på en grad av korrelasjon mellom parasitaemi og vevsinfeksjon. Et annet viktig fremskritt de siste årene har vært den TDR-sponsede studien for standardisering og laboratorievalidering av kvalitativ PCR-testing for T. cruzi. Standardiserte prosedyrer for kvalitativ vurdering av PCR (standard og sanntids PCR) som gir høyere analytisk sensitivitet og spesifisitet, reproduserbarhet, med lave nivåer av intra- og inter-assay variasjon og nøyaktighet er valgt. Resultater fra denne øvelsen har blitt presentert på et møte i Buenos Aires, 8. november, og de forventes å bli publisert i nær fremtid. Imidlertid er det begrenset informasjon om effekten av behandling for kroniske ubestemte CD-pasienter, og bare noen få studier brukte PCR for å vurdere parasitologisk respons. Et panel av eksperter i CD på tre møter arrangert av DNDi og CD-protokollutviklingsteamet ga støtte til evalueringen av PCR som en markør for parasitologisk respons ved ubestemt kronisk sykdom. Under disse diskusjonene var det konsensus om verdien av å bruke serieblodsamlinger for kvalitative PCR-analyser for å øke PCR-testfølsomheten.

Data til støtte for denne informasjonen er begrenset til en argentinsk kohort på 41 gravide kvinner som følges opp med månedlige blodprøvetakinger. I denne lille gruppen var PCR-sensitiviteten 60,2 % for en enkelt samling, 74 % for 2 blodprøvetakinger og 80,5 % for 3 blodprøvetakinger (A. Schijman, manuskript under forberedelse). I tillegg indikerte en studie fra Castro publisert i 2002 en signifikant økning fra 70,0 % til 81,7 % i sensitiviteten til PCR med tillegg av en andre prøve (P=0,03). Tilsetning av en tredje prøve førte til ikke-signifikant økning i sensitivitet til 86,7 %. Dessverre var prøvestørrelsen liten, det var ingen indikasjon på prøvetakingsintervallet og den kvalitative PCR-teknikken var ikke-standardisert. Under paneldiskusjonene var det ingen enighet om det nøyaktige intervallet for serieprøvetaking, i lys av mangelen på informasjon til støtte for et bestemt intervall for blodprøvetaking for å maksimere sensitiviteten. Data innhentet med xenodiagnose tyder på fravær av både døgnrytme og T. cruzi-periodisitet hos kroniske chagasiske individer. Når man definerer prøvetakingsprosedyrer, må man derfor balansere gevinsten på PCR-sensitivitet og logistikk/gjennomførbarhet ved å utføre kliniske studier i felt. For å forberede seg på fremtidige kliniske studier på CD, erkjenner DNDi behovet for å evaluere og optimalisere prosedyrene for PCR-implementering som et verktøy for parasitologisk vurdering hos pasienter med kronisk ubestemt form for CD. Studieetisk godkjenning vil bli søkt fra Médecins Sans Frontières Ethical Review Board og, Ethical Review Board fra Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Cochabamba, Bolivia. Videre vil studien bli sendt inn og gjennomgått av National Chagas Control Program og 'Comité de Ética e Investigación' del Ministerio de Salud, Bolivia. Dette er en beskrivende studie som tar sikte på å vurdere om flere PCR-blodprøvetakingsprosedyrer ved baseline kan gi høyere sensitivitet sammenlignet med enkeltprøvetaking, samt deres gjennomførbarhet i felt. Blodprøvetaking for baseline og EOT vil være som følger: én innledende blodprøve på 10 mL (prøve 1), etterfulgt av 1 blodprøve på 5 mL tatt umiddelbart etter (prøve 2); pluss én blodprøve på 10 ml tatt 1 uke senere (prøve 3). Totalt 3 blodprøver. Ved 6 og 12 måneders oppfølgingsbesøk vil kun den optimale prøvetakingsstrategien ved EOT brukes.

Samplingstrategier:

For å utforske PCR-sensitivitet i henhold til antall blodprøver, vil PCR-resultater bli analysert som enkeltanalyser, samt, på dataanalysestadiet, ved å kombinere PCR-resultater for pasienter på et gitt tidspunkt.

• Referanse som skal brukes Gjeldende strategi (CS): Prøve 1: Enkeltprøve på 10 ml To hovedtyper strategier kan utvikles og trenger en vurdering:
• Forsterkningsstrategi (RS) som består i å legge til blodprøvetaking(er) til gjeldende enkeltprøvetilnærming (volum på 10 ml). Med mindre ytterligere prøvetakinger ikke tillater påvisning av ytterligere PCR-positive tilfeller (noe som er usannsynlig), vil en slik strategi uunngåelig være mer sensitiv enn den nåværende.
• Substitusjonsstrategi (SS) som består i å erstatte dagens tilnærming (prøve 1 = 10 ml) med en 5 ml prøvetaking (prøve 2) og eventuelt ytterligere prøvetaking(er) (prøve 3). Disse strategiene er ikke nødvendigvis bedre enn den nåværende.

Studienettsted:

Denne studien vil bli utført i landlige samfunn i kommunene Aiquile, Omereque og Pasorapa i provinsen Narciso Campero, Bolivia, hvor Leger Uten Grenser har etablert et program for "Chagas sykdomsforebygging, diagnose og behandling" i samarbeid med de lokale. helsemyndighetene. Den lokale befolkningen er ~ 40 000 individer, som bor i et av områdene med høyest belastning av CD i landet. I sammenheng med dette programmet vil individene som bor i landlige samfunn bli screenet for Chagas sykdom, og de som oppfyller kvalifikasjonene vil bli invitert til å delta i studien. Like muligheter for behandling og behandling av sykdommen vil bli gitt av Leger Uten Grenser og dets partnere til alle Chagas-positive forsøkspersoner, til tross for deltagelse eller ikke i studien.

Hovedinngangskriterier:

Inkludering / Eksklusjon Pasienter med kronisk CD som har indikasjon for behandling med benznidazol. Pasienter må oppfylle følgende kvalifikasjonskriterier for å delta i studien:

Inklusjonskriterier:

• Alder mellom > 18 - 60 år
• Diagnose av T. cruzi-infeksjon ved Chagas-serologi. To av tre serologiske tester må være positive (konvensjonell ELISA, rekombinant ELISA eller HAI)
• Skriftlig informert samtykkeskjema

Ekskluderingskriterier:

• Kvinner i fertil alder som har positiv graviditetstest ved screening, eller som ammer Merk: Kvinner i fertil alder må akseptere å bruke en prevensjonsmetode under hele behandlingsfasen av studien
• Nåværende presentasjon av alvorlig helsetilstand som: aktiv lungetuberkulose og kliniske tegn på lever- eller nyresvikt.
• Chagas kardiomyopati stadium II, III og IV (i henhold til NYHA-klassifiseringen)
• Personer som trenger pacemakerimplantasjon eller andre alvorlige hjerteledningsfeil
• Historie med CD-behandling med benznidazol eller nifurtimox når som helst tidligere
• Manglende evne til å overholde oppfølging og/eller ikke ha fast adresse
• Historie om alkoholmisbruk eller annen rusavhengighet Merk: alle pasienter som deltar i denne studien vil bli behandlet med Benznidazol, 5 mg/kg/dag PO BID i 60 dager, i henhold til rutinemessig behandling gitt av Leger Uten Grenser i landlige samfunn i Aiquile. Denne behandlingen er i samsvar med de lokale anbefalingene fra Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia. Pasientens deltakelse i denne studien er frivillig og hans avslag eller tilbaketrekking av samtykke til enhver tid under studien vil ikke påvirke hans/hennes rett til å motta behandling for Chagas sykdom.