Otimização da Técnica de PCR para Avaliação da Resposta Parasitológica em Pacientes com Doença de Chagas Crônica (PCR)

A Doença de Chagas (DC) está entre as doenças mais negligenciadas do mundo. Na América Latina, 21 países são endêmicos para DC, com um número estimado de 108 milhões de pessoas em risco de contrair a doença. Estimativas da década de 1980 indicavam que cerca de 16 a 18 milhões de indivíduos estavam infectados. Na década de 1990, após uma série de iniciativas multinacionais de controle, as estimativas do número de pessoas infectadas foram revisadas para 9,8 milhões em 2001. A carga estimada de doenças em termos de anos de vida ajustados por incapacidade (DALYs) caiu de 2,7 milhões em 1990 para 586.000 em 2001. Estimativas recentes da Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS), de 2006, indicam 7,54 milhões de pessoas infectadas e 55.185 novos casos por ano. A DC, também conhecida como tripanossomíase americana, é uma zoonose causada pelo protozoário hemoflagelado Trypanosoma cruzi, transmitida principalmente por grandes insetos hematófagos reduviídeos da subfamília Triatominae. Clinicamente, a DC humana tem duas fases, aguda e crônica. A fase aguda, que dura algumas semanas, é uma doença febril e toxêmica, durante a qual o parasita pode ser detectado por exame direto de sangue fresco. Na fase crônica, o diagnóstico depende de hemoculturas de vários graus de sensibilidade, xenodiagnóstico, PCR ou detecção de anticorpos IgG. Não tratada, a fase crônica continua pelo resto da vida de uma pessoa. Inicia-se sem sintomas específicos ou manifestações clínicas por um período de aproximadamente 10 ou 15 anos, a "forma indeterminada" da doença. Cerca de 20 a 50% dos chagásicos crônicos ao longo dos anos, dependendo da área endêmica analisada, desenvolverão acometimento do coração ou do trato gastrointestinal. A terapia atual para DC é limitada a duas drogas nitroheterocíclicas, Nifurtimox e Benznidazol, sendo esta última a droga mais utilizada para o tratamento da doença de Chagas. As indicações de tratamento são doença aguda (incluindo infecção congênita) e doença crônica precoce (ou seja, em crianças < 15 anos de idade e pacientes na fase inicial de infecção crônica), além de reativação da infecção por imunossupressão.

A fase crônica tardia é tratada a critério do médico. Numa hierarquia de necessidades, tem-se defendido que os pacientes na fase indeterminada da doença representariam a principal população-alvo para avaliação de novos tratamentos. Com a diminuição da incidência da doença, mesmo nos países com maior número de novos casos, a maior carga de doença está entre os pacientes na fase crônica assintomática da doença. A Bolívia, por exemplo, tem pelo menos 200 mil crianças menores de 15 anos e 1 milhão de adultos infectados pelo T. cruzi, para um total estimado de 700 mil pessoas com a forma indeterminada ou assintomática, fase crônica. O desenvolvimento de tratamento eficaz e acessível para milhões de pessoas com infecções contínuas e a prevenção de complicações crônicas são reconhecidas como uma prioridade chave no controle da doença na DC. A avaliação da cura é considerada o aspecto mais complexo do tratamento na DC, levando a resultados muitas vezes diversos e controversos. O termo cura parasitológica é de difícil interpretação e desafiadora de avaliação, tendo em vista a necessidade de eliminação total dos parasitos não só do sangue, mas também dos tecidos. A cura clínica exige avaliação de longo prazo e muitas vezes é de natureza incerta devido à patogênese da doença, com a ação do parasita, a resposta do hospedeiro e suas consequentes manifestações clínicas evoluindo por longo período de tempo. Nos últimos anos, um conjunto crescente de dados apontou para uma forte justificativa biológica para o uso de resultados parasitológicos como marcadores substitutos para a doença de Chagas aguda e indeterminada. Há evidências crescentes do papel da persistência do T. cruzi na perpetuação da resposta imune e evolução da doença. Além disso, recentes ensaios clínicos não randomizados com acompanhamento de longo prazo demonstraram um efeito positivo da quimioterapia antiparasitária em pacientes com DC crônica e a correlação desses achados com os resultados da sorologia. Portanto, para fins de desenvolvimento clínico e prova de conceito, foi sugerido que testes parasitológicos e sorológicos sejam usados ​​para a avaliação da resposta em doenças agudas e crônicas. Um esfregaço direto negativo no final do tratamento é geralmente aceito como evidência de resposta em pacientes agudos. Na doença crônica, hemocultura seriada, xenodiagnóstico ou PCR podem ser usados ​​para apoiar a avaliação sorológica e um resultado parasitológico positivo indica falha no tratamento. A hemocultura e o xenodiagnóstico são técnicas que podem apresentar baixa sensibilidade em pacientes crônicos, requerem recursos/infraestrutura adequados e pessoal muito capacitado. Em relação à sorologia convencional, em pacientes crônicos indeterminados, a queda dos títulos de anticorpos pode levar até 5 anos, ocorrendo a soroconversão para negativa após 5-10 anos. Em consequência, propõe-se que a avaliação da eficácia para estudos clínicos em doença indeterminada seja feita com o uso de PCR qualitativo e quantitativo. No entanto, houve uma variabilidade significativa na sensibilidade clínica e especificidade da PCR em estudos publicados, com diferenças observadas entre as fases da doença e várias técnicas em uso que requerem padronização. Em particular, tem havido preocupação com a sensibilidade da PCR na doença de Chagas crônica devido aos baixos níveis de parasitas circulantes e flutuações naturais da parasitemia. Os estudos mais recentes têm mostrado uma ampla faixa dinâmica para o uso da PCR, permitindo medições diretas em casos com altas cargas parasitárias, como pacientes com doença de Chagas imunossuprimidos e recém-nascidos com infecção congênita, bem como em casos com parasitemias baixas, como pacientes na fase indeterminada ou sob etiologia tratamento. O teste de PCR também tem sido utilizado para detecção precoce da reativação do T. cruzi após transplante cardíaco, com detecção documentada de aumento da carga parasitária, anterior ao diagnóstico de reativação clínica. Além disso, há um acúmulo de dados clínicos e experimentais sugerindo um grau de correlação entre parasitemia e infecção tecidual. Outro avanço importante nos últimos anos foi o estudo patrocinado pelo TDR para padronização e validação laboratorial de testes de PCR qualitativos para T. cruzi. Foram selecionados procedimentos padronizados para avaliação qualitativa da PCR (PCR padrão e em tempo real) com maior sensibilidade e especificidade analítica, reprodutibilidade, com baixos níveis de variação e precisão intra e interensaio. Os resultados deste exercício foram apresentados em uma reunião em Buenos Aires, no dia 8 de novembro, e espera-se que sejam publicados em um futuro próximo. No entanto, há informações limitadas sobre a eficácia do tratamento para pacientes com DC crônica indeterminada, e apenas alguns estudos empregaram a PCR para avaliar a resposta parasitológica. Um painel de especialistas em DC em três reuniões organizadas pela DNDi e pela equipe de desenvolvimento do protocolo de DC deu suporte à avaliação da PCR como um marcador de resposta parasitológica em doenças crônicas indeterminadas. Durante essas discussões, houve consenso sobre o valor do uso de coletas seriadas de sangue para ensaios de PCR qualitativos, a fim de aumentar a sensibilidade do teste de PCR.

Os dados que corroboram essas informações limitam-se a uma coorte argentina de 41 mulheres grávidas acompanhadas com coletas mensais de sangue. Neste pequeno grupo, a sensibilidade do PCR foi de 60,2% para uma única coleta, 74% para 2 coletas de sangue e 80,5% para 3 coletas de sangue (A. Schijman, manuscrito em preparação). Além disso, um estudo de Castro publicado em 2002 indicou um aumento significativo de 70,0% para 81,7% na sensibilidade da PCR com a adição de uma segunda amostra (P=0,03). A adição de uma terceira amostra levou a um aumento não significativo da sensibilidade para 86,7%. Infelizmente, o tamanho da amostra era pequeno, não havia indicação do intervalo de amostragem e a técnica de PCR qualitativa não era padronizada. Durante as discussões do painel, não houve acordo sobre o intervalo preciso para amostragem em série, tendo em vista a falta de informações em apoio a um intervalo definido para amostragem de sangue para maximizar a sensibilidade. Dados obtidos com o xenodiagnóstico sugerem a ausência tanto do ritmo circadiano quanto da periodicidade do T. cruzi em chagásicos crônicos. Portanto, ao definir os procedimentos de amostragem, seria necessário equilibrar o ganho na sensibilidade da PCR e a logística/viabilidade na condução de ensaios clínicos em campo. A fim de se preparar para futuros ensaios clínicos na DC, a DNDi reconhece a necessidade de avaliar e otimizar os procedimentos de implementação da PCR como ferramenta de avaliação parasitológica em pacientes com forma crônica indeterminada da DC. A aprovação ética do estudo será solicitada ao Conselho de Revisão Ética dos Médicos Sem Fronteiras e ao Conselho de Revisão Ética do Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social (CEADES), Cochabamba, Bolívia. Além disso, o estudo será submetido e analisado pelo Programa Nacional de Controle de Chagas e pelo 'Comitê de Ética e Investigação' do Ministério de Saúde da Bolívia. Este é um estudo descritivo com o objetivo de avaliar se vários procedimentos de amostragem de sangue por PCR na linha de base podem fornecer maior sensibilidade em comparação com a amostragem única, bem como sua viabilidade em um ambiente de campo. A amostragem de sangue para linha de base e EOT será a seguinte: uma amostra de sangue inicial de 10 mL (Amostra 1), seguida de 1 amostra de sangue de 5 mL coletada imediatamente a seguir (Amostra 2); mais uma amostra de sangue de 10mL coletada 1 semana depois (Amostra 3). Total de 3 amostras de sangue. Nas visitas de acompanhamento de 6 e 12 meses, apenas a estratégia de amostragem ideal no EOT será usada.

Estratégias de amostragem:

A fim de explorar a sensibilidade da PCR de acordo com o número de amostras de sangue, os resultados da PCR serão analisados ​​como ensaios únicos, bem como, na fase de análise de dados, combinando os resultados da PCR para pacientes em um determinado momento.

• Referência a ser usada Estratégia atual (CS): Amostra 1: Amostra única de 10 ml Dois tipos principais de estratégias podem ser desenvolvidos e precisam ser avaliados:
• Estratégia de Reforço (RS) que consiste em adicionar amostra(s) de sangue à abordagem atual de amostra única (volume de 10 ml). A menos que amostras adicionais não permitam a detecção de casos PCR-positivos adicionais (o que é improvável), essa estratégia será inevitavelmente mais sensível do que a atual.
• Estratégia de Substituição (SS) que consiste em substituir a abordagem atual (amostra 1 = 10 ml) por uma amostragem de 5 ml (amostra 2) e possivelmente mais amostragem(ões) (amostra 3). Essas estratégias não são necessariamente melhores do que a atual.

Site de estudo:

O presente estudo será realizado em comunidades rurais dos municípios de Aiquile, Omereque e Pasorapa, na província de Narciso Campero, Bolívia, onde Médicos Sem Fronteiras estabeleceu um programa de "Prevenção, diagnóstico e tratamento da doença de Chagas" em parceria com as autoridades locais autoridades sanitárias. A população local é de aproximadamente 40.000 indivíduos, vivendo em uma das áreas com maior carga de DC no país. No contexto deste programa, os indivíduos residentes em comunidades rurais serão rastreados para a doença de Chagas e aqueles que cumprirem a elegibilidade serão convidados a participar do estudo. Oportunidades iguais de tratamento e manejo da doença serão oferecidas por MSF e seus parceiros a todos os indivíduos positivos para a doença de Chagas, independentemente da participação ou não no estudo.

Principais Critérios de Entrada:

Inclusão/Exclusão Pacientes com DC crônica que tenham indicação de tratamento com benzonidazol. Os pacientes devem preencher os seguintes critérios de elegibilidade para inscrição no estudo:

Critério de inclusão:

• Idade entre > 18 - 60 anos
• Diagnóstico da infecção por T. cruzi pela sorologia para Chagas. Dois dos três testes sorológicos devem ser positivos (ELISA convencional, ELISA recombinante ou HAI)
• Termo de consentimento informado por escrito

Critério de exclusão:

• Mulheres em idade reprodutiva com teste de gravidez positivo na triagem ou que estejam amamentando Nota: Mulheres em idade reprodutiva devem aceitar o uso de método contraceptivo durante toda a fase de tratamento do estudo
• Apresentação atual de estado de saúde grave, como: tuberculose pulmonar ativa e sinais clínicos de insuficiência hepática ou renal.
• Cardiomiopatia chagásica estágio II, III e IV (segundo classificação da NYHA)
• Indivíduos que necessitam de implante de marca-passo ou outros defeitos graves de condução cardíaca
• História de tratamento para DC com benznidazol ou nifurtimox em qualquer momento no passado
• Incapacidade de cumprir o seguimento e/ou não ter morada permanente
• Histórico de abuso de álcool ou qualquer outra dependência de drogas Observação: todos os pacientes participantes deste estudo serão tratados com Benznidazol, 5mg/Kg/dia PO BID por 60 dias, de acordo com os cuidados de rotina fornecidos por MSF nas comunidades rurais de Aiquile. Este tratamento está de acordo com as recomendações locais do Ministerio de Salud y Deportes de Bolivia. A participação do paciente neste estudo é voluntária e sua recusa ou retirada de consentimento a qualquer momento durante o estudo não afetará seu direito de receber tratamento para a doença de Chagas.