만성 샤가스병 환자의 기생충 반응을 평가하기 위한 PCR 기술의 최적화 (PCR)

샤가스병(CD)은 세계에서 가장 방치되는 질병 중 하나입니다. 라틴 아메리카에서는 21개국이 CD에 풍토병이 있으며 약 1억 8백만 명이 질병에 걸릴 위험이 있습니다. 1980년대 추정치에 따르면 약 1,600만~1,800만 명이 감염된 것으로 나타났습니다. 1990년대에 일련의 다국적 통제 이니셔티브를 거친 후 감염자 수 추정치는 2001년에 980만 명으로 수정되었습니다. 장애 조정 수명(DALY) 측면에서 추정되는 질병 부담은 1990년 270만 명에서 2001년 586,000명으로 감소했습니다. 2006년 범미보건기구(PAHO)의 최근 추산에 따르면 매년 754만 명의 감염자와 55,185명의 새로운 사례가 발생합니다. 미국 트리파노소마증으로도 알려진 CD는 원생동물 혈편모충 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)에 의해 발생하는 인수공통전염병으로 주로 트리아토미나에(Triatominae) 아과의 크고 피를 빨아먹는 붉은 벌레에 의해 전염됩니다. 임상적으로 인간 CD에는 급성 및 만성의 두 단계가 있습니다. 몇 주 동안 지속되는 급성기는 열이 나고 독성이 있는 질병이며 이 기간 동안 신선한 혈액을 직접 검사하여 기생충을 감지할 수 있습니다. 만성 단계에서 진단은 민감도, 이종 진단, PCR 또는 검출 IgG 항체의 다양한 정도의 혈액 배양에 따라 달라집니다. 치료하지 않으면 만성기가 남은 생애 동안 계속됩니다. 질병의 "불확실한 형태"인 약 10년 또는 15년 동안 특정 증상이나 임상 증상 없이 시작됩니다. 만성 샤가스병 환자의 약 20~50%는 향후 몇 년 동안 분석된 풍토병 지역에 따라 심장이나 위장관에 침범하게 됩니다. 현재 CD에 대한 치료법은 Nifurtimox와 Benznidazole의 두 가지 니트로헤테로사이클릭 약물로 제한되며, 후자는 샤가스병 치료에 가장 널리 사용되는 약물입니다. 치료 적응증은 급성 질환(선천성 감염 포함) 및 초기 만성 질환(즉, 15세 미만의 어린이 및 만성 감염 초기 단계의 환자)과 면역 억제에 의한 감염 재활성화입니다.

후기 만성 단계는 임상의의 재량에 따라 치료됩니다. 필요 계층 구조에서 질병의 불확정 단계에 있는 환자가 새로운 치료법 평가를 위한 주요 대상 집단을 대표할 것이라고 주장되어 왔습니다. 이 질병의 발병률이 감소함에 따라 새로운 사례가 가장 많은 국가에서도 질병의 무증상 만성 단계에 있는 환자들 사이에서 질병 부담이 가장 높습니다. 예를 들어 볼리비아에는 T. cruzi에 감염된 15세 미만의 어린이가 최소 200,000명 이상 있고 성인이 100만 명에 이르러 약 700,000명이 불확실형 또는 무증상 만성 단계에 있습니다. 만성 합병증 예방과 진행 중인 감염이 있는 수백만 명의 사람들을 위한 효과적이고 저렴한 치료법의 개발은 CD의 주요 질병 통제 우선 순위로 인식되고 있습니다. 완치 평가는 크론병 치료의 가장 복잡한 측면으로 간주되며 종종 다양하고 논쟁의 여지가 있는 결과로 이어집니다. 기생충 치료라는 용어는 혈액뿐만 아니라 조직에서도 기생충을 완전히 제거해야 한다는 점에서 해석이 어렵고 평가가 어렵습니다. 임상적 치료는 장기간의 평가를 필요로 하며, 기생충의 작용, 숙주 반응 및 그에 따른 임상 증상이 오랜 기간 동안 전개되는 질병의 병인으로 인해 종종 불확실한 성격을 띤다. 최근 몇 년 동안 점점 더 많은 데이터가 급성 및 불확정 샤가스병에 대한 대리 표지자로서 기생충학적 결과를 사용하는 강력한 생물학적 근거를 지적했습니다. 면역 반응의 영속화 및 질병의 진화에서 T. cruzi 지속성의 역할에 대한 증거가 증가하고 있습니다. 또한, 장기 추적 조사를 통한 최근의 비무작위 임상 시험에서 만성 CD 환자에 대한 항기생충 화학요법의 긍정적인 효과와 이러한 결과와 혈청학 결과의 상관관계가 입증되었습니다. 따라서 임상 개발 및 개념 증명을 위해 급성 및 만성 질환 모두에서 반응 평가에 기생충 및 혈청학적 검사를 사용하는 것이 제안되었습니다. 치료 종료 시 음성 직접 도말 검사는 일반적으로 급성 환자에서 반응의 증거로 받아들여집니다. 만성 질환에서 일련의 혈액 배양, 이종 진단 또는 PCR을 사용하여 혈청학적 평가를 지원할 수 있으며 양성 기생충학적 결과는 치료 실패를 나타냅니다. 혈액 배양 및 이종 진단은 만성 환자에게 낮은 민감도를 나타낼 수 있는 기술이며 적절한 자원/인프라 및 매우 숙련된 인력이 필요합니다. 기존의 혈청학에 관해서는 불확실한 만성 환자의 경우 항체 역가가 감소하는 데 최대 5년이 걸릴 수 있으며 5~10년 후에 혈청 음성으로 전환됩니다. 결과적으로 불확실한 질병에 대한 임상 연구를 위한 효능 평가는 정성적 및 정량적 PCR을 사용하여 수행할 것을 제안합니다. 그러나 발표된 연구에서 PCR의 임상적 민감도와 특이성에 상당한 변동성이 있었으며, 질병의 단계와 표준화가 필요한 여러 기술에 걸쳐 차이가 나타났습니다. 특히, 순환 기생충의 낮은 수준과 기생충혈증의 자연적 변동으로 인해 만성 샤가스병에서 PCR의 민감도에 대한 우려가 있었습니다. 최신 연구는 면역 억제된 샤가스병 환자 및 선천적으로 감염된 신생아와 같은 높은 기생충 부하가 있는 경우뿐만 아니라 불확실한 단계의 환자 또는 병인학적 상태에 있는 환자와 같은 낮은 기생충혈증이 있는 경우에서 직접 측정을 허용하는 PCR 사용에 대한 넓은 동적 범위를 보여주었습니다. 치료. PCR 테스트는 또한 심장 이식 후 T. cruzi 재활성화의 조기 감지에 사용되었으며 임상 재활성화 진단 이전에 기생 부하 증가를 문서화했습니다. 또한, 기생충혈증과 조직 감염 사이에 어느 정도의 상관관계가 있음을 암시하는 임상 및 실험 데이터가 축적되고 있습니다. 최근 몇 년간 또 다른 중요한 발전은 T. cruzi에 대한 정성적 PCR 테스트의 표준화 및 실험실 검증을 위한 TDR 후원 연구였습니다. PCR의 정성적 평가를 위한 표준화된 절차(표준 및 실시간 PCR)는 낮은 수준의 분석 내 및 분석 간 편차와 정확도로 높은 분석 감도와 특이성, 재현성을 제공합니다. 이 연습의 결과는 11월 8일 부에노스아이레스에서 열린 회의에서 발표되었으며 가까운 시일 내에 발표될 예정입니다. 그러나 만성 불확정 CD 환자의 치료 효능에 대한 정보는 제한적이며 기생충 반응을 평가하기 위해 PCR을 사용한 연구는 소수에 불과합니다. DNDi와 CD 프로토콜 개발팀이 주최한 세 번의 회의에서 CD 전문가 패널은 불확실한 만성 질환에서 기생충 반응의 마커로서 PCR의 평가를 지원했습니다. 이러한 논의 중에 PCR 테스트 민감도를 높이기 위해 정성적 PCR 분석에 일련의 혈액 수집을 사용하는 가치에 대한 합의가 있었습니다.

이 정보를 뒷받침하는 데이터는 매월 혈액 수집을 추적한 41명의 임산부로 구성된 아르헨티나 코호트로 제한됩니다. 이 소그룹에서 PCR 민감도는 단일 수집의 경우 60.2%, 2개의 혈액 수집의 경우 74%, 3개의 혈액 수집의 경우 80.5%였습니다(A. Schijman, 준비 중인 원고). 또한 2002년에 발표된 Castro의 연구에서는 두 번째 샘플을 추가하면 PCR의 민감도가 70.0%에서 81.7%로 크게 증가하는 것으로 나타났습니다(P=0.03). 세 번째 샘플을 추가하면 민감도가 86.7%로 크게 증가하지 않습니다. 불행히도 샘플 크기가 작았고 샘플링 간격에 대한 표시가 없었고 정성적 PCR 기술이 표준화되지 않았습니다. 패널토론에서는 연속채취의 정확한 간격에 대한 합의가 이루어지지 않았는데, 이는 민감도를 최대화하기 위한 채혈의 일정 간격을 지지하는 정보가 부족했기 때문이다. xenodiagnosis로 얻은 데이터는 만성 chagasic 개체에서 일주기 리듬과 T. cruzi 주기성이 모두 없음을 시사합니다. 따라서 샘플링 절차를 정의할 때 현장 환경에서 임상 시험을 수행할 때 PCR 민감도와 물류/타당성의 균형을 맞춰야 합니다. CD에 대한 향후 임상 시험을 준비하기 위해 DNDi는 만성 불확정형 CD 환자의 기생충학적 평가 도구로서 PCR 구현 절차를 평가하고 최적화해야 할 필요성을 인정합니다. 연구 윤리 승인은 Médecins Sans Frontières Ethical Review Board와 Colectivo de Estudios Aplicados y Desarollo Social(CEADES), Cochabamba, Bolivia의 윤리 검토 위원회에서 구할 것입니다. 또한 이 연구는 국가 샤가스 관리 프로그램과 볼리비아의 'Comité de Ética e Investigación' del Ministerio de Salud에 의해 제출되고 검토될 것입니다. 이것은 기준선에서 여러 PCR 혈액 샘플링 절차가 단일 샘플링에 비해 더 높은 감도를 제공할 수 있는지 여부와 현장 설정에서의 실행 가능성을 평가하는 것을 목표로 하는 설명적 연구입니다. 기준선 및 EOT에 대한 혈액 샘플링은 다음과 같습니다: 10mL의 초기 혈액 샘플 1개(샘플 1), 직후에 수집된 5mL의 혈액 샘플 1개(샘플 2); + 1주일 후에 수집된 10mL의 혈액 샘플 1개(샘플 3). 총 3개의 혈액 샘플. 6개월 및 12개월 후속 방문에서는 EOT에서 최적의 샘플링 전략만 사용됩니다.

샘플링 전략:

혈액 샘플 수에 따른 PCR 민감도를 탐색하기 위해 PCR 결과는 단일 분석으로 분석될 뿐만 아니라 데이터 분석 단계에서는 주어진 시점에서 환자에 대한 PCR 결과를 결합하여 분석됩니다.

• 사용할 참조 현재 전략(CS): 샘플 1: 10ml의 단일 샘플 두 가지 주요 유형의 전략이 개발될 수 있으며 평가가 필요합니다.
• 현재의 단일 샘플 접근법(부피 10ml)에 혈액 샘플을 추가하는 강화 전략(RS). 추가 샘플링이 추가 PCR 양성 케이스의 감지를 허용하지 않는 한(가능성이 낮음) 그러한 전략은 불가피하게 현재보다 더 민감할 것입니다.
• 현재 접근 방식(샘플 1 = 10ml)을 5ml 샘플링(샘플 2) 및 가능하면 추가 샘플링(샘플 3)으로 대체하는 것으로 구성된 대체 전략(SS). 이러한 전략이 반드시 현재보다 나은 것은 아닙니다.

연구 사이트:

현재 연구는 Médecins Sans Frontières가 "샤가스병 예방, 진단 및 치료" 프로그램을 수립한 볼리비아의 나르시소 캄페로(Narciso Campero) 지방에 있는 Aiquile, Omereque 및 Pasorapa 시의 시골 지역사회에서 수행될 예정입니다. 보건 당국. 지역 인구는 약 40,000명으로 전국에서 CD 부담이 가장 높은 지역 중 하나에 살고 있습니다. 이 프로그램의 맥락에서 농촌 지역에 거주하는 개인은 샤가스병 검사를 받고 자격을 충족하는 사람은 연구에 참여하도록 초대됩니다. 연구 참여 여부와 관계없이 모든 샤가스 양성 피험자에게 국경없는의사회와 그 파트너는 질병의 치료 및 관리를 위한 동등한 기회를 제공할 것입니다.

주요 참가 기준:

포함/제외 benznidazole 치료 적응증이 있는 만성 CD 환자. 환자는 연구 등록을 위해 다음 자격 기준을 충족해야 합니다.

포함 기준:

• > 18 - 60세 사이의 연령
• Chagas 혈청학에 의한 T. cruzi 감염의 진단. 세 가지 혈청학적 검사 중 두 가지가 양성이어야 합니다(기존 ELISA, 재조합 ELISA 또는 HAI).
• 서면 동의서

제외 기준:

• 스크리닝 시 양성 임신 검사를 받았거나 모유 수유 중인 가임기 여성 참고: 가임기 여성은 시험의 전체 치료 단계 동안 피임법 사용을 수락해야 합니다.
• 활동성 폐결핵 및 간 또는 신부전의 임상 징후와 같은 심각한 건강 상태의 현재 프레젠테이션.
• 샤가스 심근병증 II기, III기 및 IV기(NYHA 분류에 따름)
• 심장 박동기 이식 또는 기타 심각한 심장 전도 결함이 필요한 피험자
• 과거 벤즈니다졸 또는 니푸르티목스를 사용한 CD 치료 이력
• 후속 조치를 준수할 수 없거나 영구적인 주소가 없음
• 알코올 남용 또는 기타 약물 중독 이력 참고: 이 연구에 참여하는 모든 환자는 Aiquile의 농촌 지역 사회에서 국경없는의사회가 제공하는 일상적인 치료에 따라 Benznidazole, 5mg/Kg/일 PO BID로 60일 동안 치료를 받게 됩니다. 이 치료는 Ministryio de Salud y Deportes de Bolivia의 현지 권장 사항에 따릅니다. 이 연구에 대한 환자의 참여는 자발적이며 연구 기간 중 언제라도 동의를 거부하거나 철회하더라도 샤가스병 치료를 받을 권리에 영향을 미치지 않습니다.